MIKROBIOLOGISCHE GRUNDLAGEN

zur HEFEZÜCHTUNG           Teil I

Steriltechnik, Nährmedien, Wachstum von Hefen, Stammhaltung

 
          
    

       Anleitungen

Inhaltsverzeichnis

Braulabor Übersicht

PDF-Anleitungen

Stand: 28.08.2019

Impressionen aus dem MUG-Gärlabor mit 

mikrobiologischem

Hefearbeitsplatz

Impressionen aus dem MUG-Gärlabor mit 

mikrobiologischem

Hefearbeitsplatz. 

1. Mikrobiologie - Eine Kurzeinführung                               
1.1. Mikrobiologie, ein zentrales Fachgebiet der modernen Lebenswissenschaften
Hefen sind Mikroorganismen.
Die "Unsichtbaren" sind die mikroskopisch kleinen Lebewesen, von denen der Mensch inkl. der/die BierbrauerInnen lange Zeit keine Ahnung gehabt haben. 1675/76 vom holländischen Tuchhändler und Eichmeister für alkoholische Getränke, Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723) mit selbst- geschliffenen Linsen beschriebenen "sehr kleine Tierchen" waren die erstmals von einem Menschenauge beobachteten Bakterien. Diese sensationelle Entdeckung blieb aber lange Zeit noch unbemerkt und unverstanden.  Für Leeuwenhoek war Leben mit Bewegungsfähigkeit verbunden - daher war er unsicher, ob er lebende Organismen vor sich hatte, als er im Bier (!!) Hefen entdeckte, die Gasblasen erzeugten (Kohlenstoffdioxid CO2), aber sich nicht bewegten. Erst im 19. Jahrhundert wurde die Bedeutung der Mikroorganismen, insbesondere auch der Hefe bei den Gärvorgängen entdeckt (Kurzinfo). Bereits 1818 hatte C.P.F. Erxleben (1765–1831) anhand der Bierherstellung darauf hingewiesen, dass Gärung durch Pflanzenhefen verursacht werde. Th. Schwann (1810-1882) beschrieb 1839, dass die Hefe während der alkoholischen Gärung wächst. Erst die Entdeckungen von L. Pasteurs (1822–1895) zunächst bei der Milchsäuregärung, dann bei der alkoholischen Gärung wiesen eindeutig den Zusammenhang zwischen Gärungsprozessen und Mikro-organismen nach. Als verantwortliche Gärorganismen konnte er hefeartige Pilze identifizieren. Mit seinen grundlegenden Arbeiten wurde Pasteur zu einem der wichtigsten Mitbegründer der wissenschaftlichen Mikrobiologie. Info kurz, Info ausführlich.

                                                                                                                                                                                                                                                       

                                                                                                                                                                           

Leeuwenhoek-Mikroskop, ca. 1657: 1 Linse, 2 Probenhalter, 3 Gewinde zur Scharfstellung, 4 Gewinde

für richtige Höhe der Probe. Leeuwenhoek-Skizzen der "kleinen Tierchen": A Stäbchenbakterium,

B Bewegung eines kurzen Stäbchenbakteriums von C nach D; E Kokken (kugelförniges Bakterium),

F lange Stäbchenbakterien im Mund, G Spirillen, H Kokkenhaufen.

[Bild Mitte: Frischknecht, Leeuwenhoek-Replika]

Abb. 1. Leeuwenhoek entdeckt mit seinem selbstgeschlif-  fenen Linsen in seinem Mikroskop als erster Mensch Mikro- Mikroorganismen. In einem Brief vom 17. September 1683 an die Royal Society in London beschreibt und skizziert er seine Beobachtungen.

Arbeitsgebiet der Mikrobiologie.
Das Fachgebiet der Mikrobiologie befasst sich mit Organismen, die einzeln von blossem Auge  nicht sichtbar sind.
Das Auflösungsgrenze des menschlichen Auges, also zwei Punkte gerade noch als getrennt zu erkennen, beträgt 
aus der sog. deutlichen Sehweite von 25 cm  0.02-0.04 mm oder 20-40 µm (1 µm = 1/1000 mm). Die typischen 
Vertreter der sehr inhomogenen Mikroorganismen - Bakterien, Archaeen (zusammen = Prokaryoten "Zellkern-
lose") sowie die zellkernhaltigen Eukaryoten mit den Vertretern der Protozoen (= "Urtierchen"), Mikroalgen, Mikro-
pilze und vor allem Hefen) und den nicht lebenden Viren - sind alle Einzeller und sehr klein, Bakterien zwischen
0.2-10 µm, Hefen 4-8 µm, Vertreter der Protozoen 20-500 µm, Viren 0.02-0.5 µm. Zudem sind die meisten Einzeller
sehr kontrastarm und sind deshalb ohne Färbung schlecht sichtbar.
Bedeutung.
Trotz ihrer Kleinheit sind die Mikroorganismen überall vorhanden und "spürbar", häufig sind sie gar unentbehrlich.
  • Vorkommen:
       in jedem Lebensraum zu Wasser, in der Erde, in der Luft, auf und in allen Lebewesen und meist in grossen Zahlen
       (Erde: 10 000 000-1000 000 000/ 1g Gartenerde, Mensch 100 Billionen oder 100 000 000 000 000 einzelnen Zellen,
       in ihm befinden sich 10 x mehr Bakterienzellen also 1000  000 000 000 000 = 1000 Billionen Bakterien (Info).
       Auch an extremen Standorten wie über 100 heissen Quellen der Tiefsee wie radioaktiv verseuchten Standorten        Abb. 2. Grössenvergleich von Mikro-
       (alte Kernkraftwerke) lassen sich Bakterien nachweisen.                                                                                                           organismen. Länge des Urtierchens =
                                                                                                                                                                                                                     Dicke menschliches Haar = 1/10 mm =          
  • Zahlen:                                                                                                                                                                                                 100 µm.  [Quelle: Renneberg, Biohorizonte.
       Atmosphäre: Landluft < 50/m^3, Ballungsgebiete  <2'000/m^3, landwirtschaftliche Gebiete > 10'000 Pilzsporen           Urania-Verlag, Berlin 1990, mod.]    
       Hydrosphäre: Flüsse 10^11 - 10^13/m^3, See nährstoffreich (eutroph): 10^8 - 10^13/m^3, See nährstoffarm 10^8 -   
       10^11/m^3                                                                                                                                                                                          
       Pedosphäre (Boden): 10^4 - 10^8 Bodenpilze/g Trockengewicht (TG), 10^6 - 10^10 Bodenbakterien /g TG,
       Wurzelsphäre: 5x10^8 - 1.2 x 10^9/g TG
       Biosphäre: Fäkalien 1 - 5 x 10^11/g TG, Blattoberfläche 10^3 - 2.5 x 10^5/cm^2
       Mensch: Haut (Stirn) 0.2x10^6/cm^2; Hand 10^3 - 6 x 10^3/cm^2; Mund (Speichel) 10^6 - 10^8/mL; Stuhlmasse bis 10^11/g. Hautflora Mensch.
  • Bedeutung allgemein:
       - wahrscheinlich Ursprung des Lebens vor mindestens 3.8 Mrd. Jahren
       - entwickelten die einzigartige lebensermöglichende Fotosynthese (--> Luftsauerstoff für alle atmenden Lebewesen inkl.Mensch, alle Nahrungsmittel)
       - Verursacher bzw. Mitspieler wichtiger globaler Stoffwechselkreisläufe (CO2-Kreislauf, Sauerstoff-, Stickstoff-, Phosphorkreislauf), Abbau toter
         Biomasse (z.B. alles tote pflanzliche und tierische Material --> natürliche Düngesalze für Pflanzen)
       - reinigen Abwässer, Gewässer allgemein (Selbstreinigung), sanieren Böden, bauen giftige Abfallstoffe ab u.v.m.
  • Bedeutung für Menschen: Info
       - Darmflora: schliesst Nahrungsbestandteile auf ("Verdauungs-
         helfer"), Vitaminproduzenten (Biotin, Folsäure, Vitamin K)
       - harmlose Besiedler der menschlichen Haut verhindern Einnisten 
         von krankheitserregenden Bakterien und Pilzen
       - Antibiotika- und Impfstoffproduzenten
       - Erreger von Infektionskrankheiten
       - Lebensmittelindustrie: Produzenten von Joghurt, Brot, Sauerkraut,
         alkoholische Getränke (Wein, Bier)
       - Produzenten vieler industriell wichtiger Rohstoffe (z.B. Alkohol,
         Säuren, Enzyme, Kunststoffe u.v.m.)
       - Einsatz in der Biotechnologie: Produzenten von Ethanol, Milch-
         säuren, Aceton, Medikamente                                                                      
       - gentechnisch veränderte Bakterien produzieren z.B. Impfstoffe,          Abb. 3. Produkte und Leistungen der Mikroorganismen.       
         therapeutisch einsetzbare Wirkstoffe wie Insulin.                                     [Quelle: Frischknecht, aktuell 5/94]
  • Bedeutung in der Biotechnologie:  
       Folgende Eigenschaften machen Mikroorganismen zu höchst interessanten Partnern der Biotechnologie.
       - hohe Vermehrungsgeschwindigkeit
       - enorme Stoffwechselleistungen (z.B. Proteinproduktion pro Tag: 250 kg schweres Rind - 0.12 kg, 250 kg Sojapflanzen - 18 kg, 250 kg Hefen 360 kg;
         250 kg Bakterien - 25'600 kg)
       - hohe Spezifität der Stoffumwandlungen
       - vielfältige Synthese- und Abbauleistungen
       - Reaktionsabläufe unter Normaldruck und bei Temperaturen zwischen 20-40°C.
Infos zur Mikrobiologie: Allg. Mikrobiologie   Medizinische Mikrobiologie    Mikrobiologischer Garten   Kurzeinführung (Skript)
1.2. Mikrobiologie im Gärlabor - Ausstattung und allgemeine Grundregeln
1.2.1. Ausstattung eines einfachen Gärlabors für mikrobiologische Methoden                                           Ausstattung Gärkeller/Gärlabor  allgemein hier
Zur Minimalausrüstung eines mikrobiologischen Braulabors gehören:   
(Lieferanten Laborartikel aller Art inkl. Messgeräte: Carl Roth    Bachmann > Laborgeräte/Glaswaren pdf)

- elektronische Waage (mindestens 0.1 g genau, besser 0.01 g)
- Spatel, Löffel zum Chemikalien abmessen (Info)
- Haushaltpapier, Kosmetikzellstofftücher (z.B. Linsoft)
- Magnetrührer und Magnetstäbchen (Info, z.B. Mini-Magnetrührer)
- Erlenmeyerkolben (EMK, ohne bzw. besser mit Schikanen) für Flüssigkulturen (Info), z.B.
  mit Schraubverschlusskappen, EMK mit Schikanen)
- Watte und Aluminiumfolien (besser: Alukappe passend auf EMK, z.B. CAP-Kappen)
- Dampfkochtopf zum Sterilisieren (Info)
- Heizplatte (Info)
- Bratschlauch (Dampf-hitzebeständiger Polyester) zum Einpacken von Sterilisationsgut wie
   z.B. Pipetten, Reagenzgläser (z.B. Toppits, Info z.B. bei Coop Schweiz)
- Timer (Info)
- hitzefeste Handschuhe
- Bunsenbrenner (Campinggasbrenner, Info)
- Impföse im Impfösenhalter (Info  Info)
- Reagenzgläser randlos (RG) und RG-Ständer (Info  RG: 180x18 mm, Info)
- Alukappen passend zu RG (Info)
- Drigalsky-Spatel
- Thermometer (Info) bzw. einfaches Digital-Thermometer (Info)
- Bechergläser, z.B. 1000 mL, 500 ml, 100 mL (Info)
- Sterilpipetten (z.B. Einweg aus Kunststoff, Pasteurpipetten aus Glas - sterilisierbar, Info  Info)
- pH-Meter oder pH-Papiere (z.B. pH 5 - 10) (Info  Info)
- Petrischalen (Einweg-Kunststoff, steril; oder Glas-Petrischalen, sterilisierbar) (Info  Info)
- graduierte Messzylinder 100 mL (Info)                                                                                                  
- graduierte Messbecher 1000 mL (Info)                                                                                                                       
- Augenschutzbrille (Info)                                                                                                                                                
- Pinzetten (Info)
                                                                   
                                                                                                                                            
Erweiterte Ausrüstung für ein Braulabors:                                                                                                                     
- Mini-Brutschrank für Hefezüchtung z.b. Mini-Brutschrank Cultura (Info)  
- Heizungsplatte  (Hefeanzucht in grösseren Mengen) (Info)                                                         
- Magnetrührer mit Drehrichtungswechsel, z.B. lab disc (Info)
- Digital-Refraktometer (Info)
- Digital-Thermometer (Info)
- Entsorgungsbeutel (dampfsterilisierbares Polypropylen, für Sterilisationszwecke) (Info)
- Sterilindikatorbänder (Info)
 
Wunsch-Ausrüstung für ein Braulabors:
- Mini-Brutschrank für Hefen (z.B. Info)
- Sicherheits-Laborgasbrenner mit Fusspedal (Info)]
- Lichtmikroskop/ Labormikroskop (Info  Info) inkl. Zubehör (Objektträger, Deckgläser, Zählkammer,
  Farbstoffe z.B. Methylenblau [Vitabilitätstest], mikroskopische Pinzette)
- LowCost-Fotometer zur Hefe-Wachstumsbestimmung (Info)
- Dispenser-Pipette (z.B. Accumax PRO Pipette 100-1000 µl, Info)
   mit Accumax Zips 200-1000 1000 µl) für Verdünnungsreihen
- Tilt-Hydrometer (kontinuierliche Extraktgehaltsbestimmung SG (rel. spezifische Dichte) im Gärtank (Info)
- Messgerät für Gelöst-Sauerstoff (Info)
- Heizung/Kühlung für Gärtank während Hauptgärung (BrewJacket Info)
- Gäraktivität CO2-Entwicklung (GÄRSPUNDmobil Speidel Info, oder PLAATO Airlock Info)
- Hefezellzahl (Hefekonzentration, Hefeviabilität (Oculyze-Mikroskop, Info)

Chemikalien:
Grundchemikalien:
- dest. bzw. entionisiertes Wasser
- Aluminiumfolien
- Watte
- Agar-Agar
- Malzextrakt für Brauzwecke oder Laborzwecke (cf. Nährmedien)
- Ethanol 70% (Desinfektionsmittel)
- iso-Propanol 65% (Desinfektionsmittel)
- weitere Desinfektionsmittel (siehe Brauzubehör > Desinfektions-
  mittel)
------------------------------------------------------------------------------------------------
fortgeschrittenes Braulabor:
- physiologische Kochsalzlösung
  (= 0.9%ige [w/v] Natriumchloridlösung)
 -0.1mol/L Salzsäurelösung
- 0.1 mol/L Natriumhydroxidlösung
- Phosphatpuffer 7.20 [5.8-7.8] (KH2PO4, Na2HPO4)
- Färbelösungen (Methylenblau)
- Hefenährstoffe (Wyeast [Info], White Labs WLN1000  [Info]
  Servomyces [Info], Go-Ferm [Info])
Abb. 4. Glaswaren, die unentbehrlich zur Hefe-      anzucht sind: Erlenmeyerkolben (EMK) mit Schikanen und Alukappe, EMK mit Wattepfropfen (Wattepropfen 
mit Alufolie abgedeckt = Ersatz für Alukappe), Reagenz-
gläser mit und ohne Alukappen, 2 Schrägagar-Stamm-
kulturen; oben: Reagenzglasständer aus Edelmetall.
Abb. 5. Weitere notwendige Glaswaren: 
Bechergläser (z.B. 1000 mL, 100 mL), Glasmesszylinder (z.B. 100 mL, 25 mL), Trichter (Glas, Kunststoff), ver-schliessbare Glasflaschen (z.B. für Pufferlösungen).
Abb. 8. Mikrobiologischer Arbeitsplatz. Von links nach rechts (auf weisser Keramikplatte): Petrischalen-Drehteller, Abfallbehälter für Sterilisationsgut (z.B. verbrauchte Schrägagarkulturen), Block mit Impfösen, Kosmetikzellstofftücher, Desinfektionstücher in Plastikdispenser,  Gasanzünder, Parafilmfolie, Schutzbrille, diversen Desinfektionsmittel (für Hände, Oberflächen), weisse Wanne mit Zubehör (Pinzetten, Reagenzglasklammer, wasserfeste Schreiber, Präpariernadel, Drigalsky-Spatel u.a.), grüner Holzstab (zum Schräglegen frisch gegossener Schrägagar-Kulturröhrchen), Reagenzglasgestell, 2 Gasbrenner, Gasbrenner mit Fusspedal zum Abflammen, Handschuhe , Mundschutz, Plexiglas-Schutzhaube, diverse mikroskopische Hilfsmittel (Objektträger, Deckgläser, Färbelösungen), Lichtmikroskop, Methodenfachbuch.
Abb. 9. Ersatz für Autoklaven: Dampfkochtöpfe auf Heiz- platten. 
Links: niedrige Form (mit Timer), z.B. für Reagenzgläser, kleine Erlenmeyerkolben, Schlauchmaterial, Sterilfilter u.a.
Rechts: hohe Form, für grössere Gefässe, z.B. Nährlösungen in Litermengen.
1.2.2. Der sichere und "saubere" Umgang mit Mikroorganismen im Heimlabor
Die folgenden Sicherheits- und Arbeitsratschläge sind sind aus der Erfahrung mit Lernenden (Sekundarschulstufe, Gymnasialstufe, Anfänger Hochschulstufe)entstanden und auch mit Vorteil im eigenen Heimlabor anzuwenden. 
Allgemeine Grundregeln zur "Good Lab Practice"
  1. Arbeitsplatz: Arbeitsflächen sollen frei von nicht benötigten Materialien (Schreibwerkzeuge, Notizen, Glaswaren, Nahrungsmittel, Getränke u.a.) sein. Alles zum Arbeitsablauf benötigte Material sollte bereit gestellt und in direkter Nähe sein, um unnötige Bewegungen zu vermeiden.
  2. Bekleidung: wallende Kleider sind zu vermeiden. Lange Haare nach hinten binden oder mit Stirnband bändigen (Verbrennungsgefahr durch Gasbrenner!).
  3. Arbeitsplatz-Reinigung/Desinfektion: Die Arbeitsfläche muss vor und nach der Arbeit mit einem Desinfektionsmittel "kräftig nass"abgewischt werden (z.B. Ethanol 70-75%ig, iso-Propanol 65%ig, kommerzielle Wischtücher (z.B. Info). Einwirkungszeit optimal ca. 15 min.
  4. Staubentwicklung: um Staubentwicklung und damit Kontaminationen zu verhindern, schliesst man Fenster und Türen und vermeidet während des Arbeitens unnötiges Hin- und Hergehen. 
  5. Grundhandling: Der Heimbrauer sollte über die notwendigen Grundkenntnisse im Umgang mit Mikroorganismen (Hefe) kennen und vorher "trocken" eingeübt haben, z.B. korrektes Abflammen der Geräte wie Impföse und Reagenzglas, Desinfizieren von Arbeitsflächen, Gegenstände und Hände.
  6. Beschriftung: Die Beschriftung der Glaswaren, Petrischalen, etc. sollte mit einem wasserfesten Filzschreiber oder mit selbstklebenden Etiketten erfolgen. Beschriftung umfasst Datum, Kurzbezeichnung Nährmedium (z.B. HMAS  - Hefemalzagar Standard, MEA - Malzextrakt Anzuchtmedium o.ä.), Name Organismus, Zweck (z.B. Stammkultur, Erzielung Einzelkolonie).
  7. Braumikroorganismen: Es sollten nur sichere Braumikroorganismenstämme (Hefen, Bakterien) eingesetzt werden, d.h. die Beschaffung erfolgt von zuverlässigen Quellen (White Labs, Wyeast, Lallemand Danstar, cf. Liste) bzw. durch deren Zwischenhändler wie Sevibräu u.a. Bei selbst isolierten Hefen sollten die Erahrungen und Ratschläge der bereits erfolgten Brauversuche berücksichtigt werden (Info   Info   Info). Keine problematischen Mikroorganismenquellen (Erde, Abwasser, Fäkalien u.a.) als Hefelieferanten nutzen.
  8. Stammkultur-Haltung: Wenn Stammkulturen gehalten werden, so sollten sie bei längerer Pause auf Kontamination untersucht werden: Strichtest zur Erzielung von Einzelkulturen und Kontrolle auf abweichende Kolonien. Stammkulturen auf Schrägagar sollten regelmässig z.B. jedes halbe Jahr überimpft werden.
  9. Abflammen von Impfösen: Das Abflammen von mit unbekannen Mikroorganismen beladenen Impfösen kann zum Verspritzen oder zur Aerosolbildung führen. Solche Kontaminationen können durch Eintauchen der Impfösen in 70% Ethanol, anschliessendem Abtropfen und Abflammen verhindert werden. Das Abflammen vor und nach der Verwendung soll in voller Länge der Impfösen bis zur Rotglut erfolgen.
  10. Handhabung von Kulturgefässen: Kulturgefässe (z.B. Erlenmeyerkolben, Schrägagarkulturen) dürfen nur so lange wie unbedingt notwendig geöffnet werden. Die Öffnungen der Kulturgefässe sind vor und nach der Entnahme von Keimmaterial abzuflammen. Gleiches gilt auch für Organismenbeutel von Wyeast und White Labs: Scheren zum Aufschneiden mit z.B. iso-Propanol entkeimen, ebenso die Hefepackungen vor dem Aufschneiden (und ca. 30-60 s Desinfektionsmittel einwirken lassen).
  11. Verschluss von Schrägagarröhrchen, Petrischalen, Kulturgefässe: jede beimpfte Platte bzw. Röhrchen für eine längerer Haltbarkeit verschliessen, z.B. mit einem Klebeband oder mit einer Folie und im Kühlschrank aufbewahren.
  12. Inkubationstemperaturen: Inkubation bei 37°C führt zur Selektion von Mikroorganismen, die sich an Körpertemperaturen angepasst haben und mit grösserer Wahrscheinlichkeit pathogene Formen sein könnten. Daher sollen wenn immer möglich sämtliche Kulturen bei tieferen Temperaturen (z.B. 30°C) oder dem entsprechenden Hefe-/Mikroorganismusstamm bzw. Zweck angepassten Temperatur  durchgezogen werden.
  13. Petrischalen-Auswertung: Die Auswertung von bewachsenen Agarplatten mit heikleren Proben (z.B. Luftfangplatten zur Gewinnung von lokalen Hefestämmen [wild yeasts]) sollte nicht mit offener Platte durchgeführt werden. Die Auswertung sollte immer auf Haushaltpapier erfolgen und am Schluss die darunter liegende Oberfläche mit einem Desinfektioinsmittel "gereinigt" werden.
  14. Schimmelpilzkulturen: Beim Umgang mit unerwünschten Schimmelpilzkulturen (z.B. gewachsen auf Hefe-Schrägagarkulturen) ist besondere Sorgfalt notwendig: die Kulturen dürfen nicht geöffnet werden und sollten im Dampfkochtopf autoklaviert (= abgetötet) werden.
  15. Händereinigung: Sowohl vor als auch nach der mikrobiologischen Arbeit sollten die Hände zuerst mit Seife gründlich gewaschen und dann z.B. mit Sterillium desinfiziert werden (Info).
Entsorgung von Mikroorganismen (Kulturen, kontaminierte Glaswaren u.a.)
  1. Entsorgung von Kulturen/Petrischalen: Gebrauchte Kulturen in Erlenmeyerkolben, in Schrägagarröhrchen oder bewachsene Agarplatten u.ä. dürfen nicht einfach abgegossen oder in den Abfalleimer geworfen werden (Gefahr des nachträglichen Wachstums pathogener Mikroorganismen).
       Erste Möglichkeit: man lässt entweder eine konzentrierte Lösung eines Desinfektionsmittels (am einfachsten und billigsten: 70% Ethanol) 6 Stunden oder
       länger (z.B. über Nacht) einwirken. Dann erst in einem separaten Plastikbeutel eingebunden dem Kehricht übergeben, wo später i.d.R. eine Verbrennung
       stattfindet.     
       Zweite Möglichkeit: man autoklaviert das Kontaminationsgut vor der Kehrichtübergabe (optimal in einem nicht ganz geschlossenen hitzestabilen
       Vernichtungsbeutel) und übergibt diesen dann dem üblichen Kehrichtsack.
    2. Arbeitsplatz/Geräte: Dekontamination von Arbeitsflächen, Geräten u.a.: Arbeitsflächen wie oben unter Allgemeine Grundregeln "3. Arbeitsplatz-Reinigung/
        Desinfektion" beschrieben behandeln. Geräte: mit Handschuh-geschützten Händen Kosmetiktüchlein mit Desinfektionsmittel tränken und Gegenstand
        abwischen, evtl. Oberfläche abflammen (z.B. Glas, Metallgegenstände, Impföse).  Alternativ: kontaminierte Gegenstände in Desinfektionsmittelbad
        einlegen, Dauer gemäss den Angaben für das entsprechende Desinfektionsmittel.
    3. Pipetten: Mit Mikroorganismen in Berührung gekommene Pipetten werden unmittelbar nach Gebrauch  - ohne auf den Arbeitsplatz abzulegen - in einen
        mit Desinfektionsmittel gefüllten Behälter getellt. Einwirkungszeit: mindestens 1/2 Stunde bzw. nach Angaben des Desinfektionsmittel-Herstellers.
Auch das gehört zur guten Braumikrobiologie-Praxis ...
  1. Protokoll: über jeden "Versuch" ist ein kurzes, aber verständliches Protokoll anzulegen.
  2. Beschriftung: immer jedes mit Organismen bestücktes Material, das aufbewahrt wird und sei
       es nur kurzfristig, eindeutig beschriften.
   3. Lernen durch Misserfolge: Durch Misslingen sollte man sich nicht entmutigen lassen. Nach
       kritischem Durchdenken und gedanklichem Durchspielen des Versuches, Schritt für Schritt im
       Kopfe den Versuch wiederholen.
   4. Lernen durch Weiterbildung: durch Studium von Artikeln in Bier(fach)zeitschriften und Bier-
       büchern (cf. diese Website > Brauliteratur/Fachliteratur und Informationenen - online) erweitert
       man sein experimentelles und allgemeines Fachwissen.
   5. Erfolg: Nur gute Planung, rechtzeitige Materialbeschaffung und Bereitstellung, grösste Ordnung,
       Sauberkeit und Übersichtlichkeit, Ausdauer und Interesse führen zum Erfolg.

Abb. 10. Das Studium von Fachliteratur erweitert das theoretische und handwerkliche Wissen zur Mikrobiologie des Bieres. Fachzeitschriften hier.

Bsp.: Hagen, R., Heimbrauen für Fortgeschrittene. 4. Aufl. 2017. Verlag Carl Hans, Nürnberg.

Rajotte, P. First steps in Yeast culture. 2nd printing, 2000. Alliage Editeur, Montreal. 

White, C., Yeast. The practical guide to beer fermentation. 2010. Brewers Publication, Boulder

 

ÜBERBLICK: im Heimbraulabor einsetzbare mikrobiologische VERFAHREN rund um HEFEN und BAKTERIEN            PDF

1 Lichtmikroskopisch basierte Methoden der Hefecharakterisierung

Braulabor 1:     Lichtmikroskop - eine allgemeine Einführung in die Mikroskopie (7 Grundlagen)  - Anleitungen  Info
Braulabor 2:     Lichtmikroskop - Kurzfassung korrektes Mikroskopieren  Anleitung
Braulabor 3:     Mikroskopische Untersuchung der Hefepilze (Frischpräparat, Kontamination, Färbemethoden, Bestimmung Zellgrössen) -
                             Anleitungen hier.
Braulabor 4:     Hefequalität I: Viabilitätstest ("Lebensfähigkeit") - Anleitung
Braulabor 5:     Gesamthefezellzahlen bestimmen - Anleitung
2 Wachstum basierte Methoden der Hefekultivation
Braulabor 6:     9 Minimaltechniken zu"Steriles bzw. keimarmes Arbeiten" - Vorgehen siehe unten. Liste Desinfektions-/Reinigungsmittel hier
Braulabor 7:     Nährmedienrezepte für Hefen und Bakterien - Vorgehen siehe unten
Braulabor 8:     Herstellung flüssiger und fester Nährmedien - Vorgehen siehe unten
Braulabor 9:     Kultivierung von Hefen in flüssigen Nährmedien - Anleitung
Braulabor 10:   Kultivierung von Hefen auf festen Malzagarmedien - Anleitung
Braulabor 11:   Bestimmung der Lebendzellzahl (Verdünnungsreihe) - Anleitung
Braulabor 12:   Bestimmung der optischen Dichte einer Hefeflüssigkultur - Anleitung hier    (In Bearbeitung)
Braulabor 13:   Erzielung einer Einzelkolonie im Ausstrichverfahren  - Anleitung
Braulabor 14:   Hefe-Stammkulturen auf Schrägagar - Variante 1 aus Hefe-Flüssigkultur hier, Variante 2 aus Hefe-Stammkultur  hier
Braulabor 15:   Hefe-Stammkulturen in Hefe-Kryoröhrchen - Anleitung   Info Kryoröhrchen
Braulabor 16:   Kontrolle der Stammreinheit - Anleitung
Braulabor 17:   Isolation und Anreicherung wilder Hefen - Anleitung
Braulabor 18:   Isolation von Bierhefen aus kommerziellen Bierflaschen - Anleitung
MIKROBIOLOGISCHE ANLEITUNGEN BRAULABOR  TEIL II:
Die Anleitungen 3 - 6 (Braulabor 19-32 sowie die 14 Handlingtipps) umfassen das wichtige Thema der Beimpfung der sterilen Bierwürze  mit vitalen Hefezellen und der optimalen Konzentration, ergänzende Untersuchungen zur Gärleistung und Gesundheit der Hefen sowie ein Spektrum von interessanten Zusatzversuchen und Tipps zur Mikrobiologie der allgegenwärtigen Hefen und anderer Mikroorganismen.
3 Anzucht der Anstellhefen                                                                                                      --> Mikrobiologisches Braulabor II 
Braulabor 19:    Bestimmung der optimalen Anstellzellzahl (Hefegabe) - Vorgehen
Braulabor 20:    Hefestarter: Anzucht der Anstellhefen - Anleitung
Braulabor 21   Beimpfung der Anstell-Bierwürze - Anleitung
4 Physiologische Leistungen der Hefe
Braulabor 22:     Hefequalität II: Bestimmung der Hefevitalität - Anleitung
Braulabor 23:     Bestimmung der Gäraktivität  (GF)  - Anleitung
5 Weitere Aspekte zur Mikrobiologie der Hefe inkl. Brauprozesse
Braulabor 24:     Wie überwacht und regelt man den Gärprozess? - Anleitung
Braulabor 25:     Haltbarkeit/Aufbewahrung von Hefen - Hinweise
Braulabor 26:     Wie keimreich ist die Luft im Braukeller? - Anleitung
Braulabor 27:     Kolonienmorphologie: Wie kann ich das Aussehen von
                               Kolonien (Hefen, Bakterien, Mikropilze) beschreiben? - Anleitung
Braulabor 28:     Rasche Hefezellzählung und Viabilitätsbestimmung mit Oculyze-
                               Smartphone-Mikroskop  -   Anleitung
Braulabor 29:     Bestimmung der Dichte (Extraktgehalt) von Stamm- und Gär-
                               würzen mit verschiedensten Verfahren - Anleitung
Braulabor 30:     Bestimmung der "Gesamtkeimzahl" (KBE - Kolonie bildende Einheiten der aeroben mesophilen Keime) - Anleitung
Braulabor 31:     Nachweis mikrobieller Bierschädlinge - Anleitung
Braulabor 32:     Nachweis des zweiten Gärproduktes: Ethanol als energiereiches Endprodukt  (GF)  - Anleitung
GF   Grundlagenversuch zur Wissenserweiterung

6    14 Handlingtipps  (Kurzanleitungen)

Nr. 1  Grundausstattung mikrobiologisches Braulabor PDF 

Nr. 2  Einrichten eines mikrobiologischen Arbeitsplatzes PDF 

Nr. 3  Überimpfen mit nur 2 Händen   PDF

Nr. 4  Inkubation von Hefen   PDF

Nr. 5  Wahl der Brauhefen   PDF

Nr. 6  Keimreduktion ohne Schnellkochtopf   PDF

Nr. 7  Kühlverfahren während Gärungsprozess   PDF

Nr. 8  Rehydrierung von Trockenhefen   PDF

Nr. 9  Gefässe verschliessen - wie, wozu?   PDF

Nr. 10  Sterile Impföse durch Ausglühen   PDF

Nr. 11  Links zu wichtigen bierischen Berechnungen   PDF

Nr. 12  Karbonisierung ohne Probleme   PDF

Nr. 13  Extraktwerte: Begriffe und Dimensionen   PDF

Nr. 14  Bieranalytik: Überblick Bierkenngrössen   PDF

 
1.3. Grundlegende Arbeitstechniken im Hefelabor
1.3.1. Lichtmikroskopisch basierte Methoden der Hefecharakterisierung
Mikroorganismen wie Hefen sind im Mikroskop sichtbar.
Die meisten Mikroorganismen sind nur im Lichtmikroskop bzw. im Elektronenmikroskop sichtbar. Die Vergrösserung erreicht den Faktor von ca. 1000 (10 E3), das Auflösungsvermögen ca. 0.25 µm. Mikroskopierverfahren: Hellfeldmikroskopie (Durchlichtverfahren, meistverbreitet, Färbung meist unabdingbar), Dunkelfeld-Mikroskopie (Objekte hell vor dunklem Hintergrund, guter Kontrast); weitere Verfahren, weniger für den Heimbrauer: Phasenkontrast-Mikroskopie, Fluoreszenzmikroskopie, konfokale Mikroskopie.
Info.
Braulabor 1: Lichtmikroskop  -  allgemeine Einführung in die Mikroskopie
Das Lichtmikroskop ist zur Betrachtung der Hefegestalt (Morphologie), zur Bestimmung der Gesamtzellzahl, der Lebendzellzahl
(Vitalfärbung) und auch zur Feststellung, ob eine Flüssigkultur mit anderen Mikroorganismen kontaminiert ist, unentbehrlich.
Voraussetzung dazu ist die Beherrschung der elementaren Grundkenntnisse zur korrekten Bedienung des Mikroskopes.
In dieser Einführung werden neben einer allgemeinen Einführung in die Lichtmikroskopie folgende Praxisthemen behandelt:
  • Grundausrüstung zum Mikroskopieren
  • Kennen lernen der Teile  eines Lichtmikroskopes und deren Funktion
  • das Zentrieren (Köhlern) des Lichtmikroskops --> schärferes Bild, optimale Beleuchtung
  • das korrekte Mikroskopieren
  • Kontrastverfahren (bei guten Mikroskopen)
  • Fehlersuche/-behebung bei schlechten Mikroskopierergebnissen
  • Pflege und Gebrauchshinweise des Lichtmikroskops.
PDF-Dokument "Grundlagen zur Lichtmikroskopie"
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Braulabor 2: Lichtmikroskop  -  korrektes Mikroskopieren (Kurzfassung)
Im Hefelabor ist das Lichtmikroskop ein wichtiges Arbeitsinstrument, dessen korrekte Bedienung selbstverständlich sein
sollte. Diese Kurzanleitung fasst die wesentlichen Punkte des korrekten Handlings in 4 Hauptpunkten zusammen und kann
als rasche Repetition des Grundwissens dienen.
PDF-Dokument "Kurzfassung korrektes Mikroskopieren"
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Anleitung  Braulabor 1:

Eine allgemeine Einführung in die Lichtmikroskopie mit 7 Grundtechniken.

Anleitung  Braulabor 2:

Kurzfassung korrektes Mikroskopieren.

 
 
 
Braulabor 3: Mikroskopische Untersuchung der Hefepilze 
Die einfachste Art der Untersuchung ist die Lebendbeobachtung der Mikroorganismen als Frischpräparat --> Anleitung Frischpräparat.
Zur besseren Kontrastierung und zum Erkennen zellulärer Details müssen allerdings Färbungen durchgeführt werden. Aus den zahlreichen Färbe- und Nachweisverfahren werden hier deren drei beschrieben (Färbung in Lugolscher Lösung, Methylenblau, Nachtblau). --> Anleitung Färbe- und Nachweisverfahren.
Verfahren: Untersuchung einfacher Hefepilze
Material: Bierhefen, Bäckerhefe, Wildhefen
Methoden: Lebenduntersuchung (Hellfeld, Dunkelfeld, Phasenkontrast), Färbungen, Zellgrössenbestimmung
Beobachtungen: Zellformen, Hefe-Sprossung, Kontamination Hefekulturen.    cf. Hefe-Bilder.
PDF-Dokument: "Mikroskopische Untersuchung der Hefezellen" mit Frischpräparat Hefezellen, 
                             Beobachtung von Kontaminationen, 3 Färbeverfahren (Methylenblau, 
                             Lugolsche Lösung, Nachtblau), Viabilitätstest, Zellgrössenbestimmung. 
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Anleitung  Braulabor 3:

Lichtmikroskopische Untersuchung von Hefezellen

 
Braulabor 4: Lebende und tote Zellen bestimmen - Viabilitätstest  
Die Anzahl (--> Braulabor 5) und der Anteil an lebenden Hefezellen (sog. Viabilität) ist einer der wichtigsten Faktoren, welche sowohl den Geschmack als auch die Qualität des Bieres beeinflussen. Vitalfarbstoffe sind in der Mikroskopie verwendete unschädliche organische Farbstoffe zur Anfärbung von lebendem Gewebe oder von Organismen, besonders Mikroorganismen, zur besseren Sichtbarmachung oder Kontrastwirkung unter dem Mikroskop. 
Mit bestimmten Vitalfarbstoffen lassen sich Vitalfärbungen zur Gewinnung von Informationen über den physiologischen Zustand der Zellen nutzen: sind die Zellen intakt, sind sie aktiv (lebendig), sind sie inaktiv (tot)?
Verfahren: Färbeverfahren mit Methylenblau
Material: Hefen
Methoden: Anfärbung von Hefezellen mit Methylenblau, lichtmikroskopische Auswertung
Beobachtungen: Vitale (farblose) und tote (blau gefärbte) Zellen.
 
Genaues Vorgehen: PDF-Dokument  "Viabilitätstest"
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Anleitung  Braulabor 4:

Lebende vs. tote Hefezellen

 

Anleitung  Braulabor 5:

Gesamtzellzahl Hefen

Braulabor 5: Gesamtzellzahlen bestimmen 
Die Anzahl Hefezellen pro Volumeneinheit neben deren Gesundheit und Viabilität (cf. Braulabor 4) sowie die Stammwürze (engl. Original Gravitiy OG) sind wohl die wichtigsten Faktoren, welche sowohl den Geschmack als auch die Qualität des Bieres beeinflussen (cf. Info). Einheitliche und reproduzierbare Gärungsverläufe sind nicht möglich ohne konsistente und adäquate Anstellkonzentrationen (Info). 
Verfahren: lichtmikroskopische Untersuchung
Material: Frische Brauhefen aus einer Anzuchtkultur (Anstellkultur) bzw. kommerzielle erworbenen Hefekultur
Methoden: mikroskopische Zellzahlbestimmung mittels Zählkammer, evtl. mit Vitalfärbung (Methylenblau)
Beobachtungen/Resultate: Gesamtzellzahl evtl. inkl. Viabilität.
PDF-Dokument: "Gesamtzellzahlen bestimmen"
siehe auch "Braulabor  28 Rasche Hefezellzählung und Viabilitätsbestimmung (System "Oculyze")

1.3.2. Grundlegende mikrobiologische Techniken - Sterilisation, Desinfektion

Die folgenden Methoden sind alle auf eine "Minimaltechnik steriles Arbeiten" angewiesen. Daher werden zunächst einige wenige theoretische Grundlagen, dann die minimalen Kenntnisse zur Steriltechnik für die Heimpraxis vorgestellt: 1. Sterilisation durch trockene Hitze, 2. Sterilisation durch feuchte Hitze, 3. Sterilisation duch Filtration (Sterilfiltration), 4. Chemische Sterilisations-, bzw. Desinfektionsverfahren.

Anschliessend werden die wichtigsten Nährmedien zur Hefenanzucht und spezielle Bakterienkulturen behandelt.

Kurzerklärung wichtiger hygienischer Begriffe

  • Sterilisation: Mit Sterilisation bezeichnet man Verfahren, durch die Materialien, Gegenstände und Flüssigkeiten von lebenden vermehrungsfähigen Mikroorganismen einschliesslich deren Ruhestadien oder Dauerformen (z.B. Sporen) befreit werden. Der dadurch erreichte Zustand heisst steril oder keimfrei. Im Idealfall werden alle enthaltenen oder anhaftenden Mikroorganismen einschliesslich deren Dauerformen abgetötet. Viren und Prionen (infektiöse Partikel) sind weder Keime noch selbstständig lebende Organismen: daher spricht man hier von Inaktivierung.  

       Die wichtigsten Sterilisationsverfahren sind Abtötung durch Hitze: 1. feuchte Hitze (Autoklavieren = Dampfsterilisation)​, 2. Trockene Hitze: Heissluft-

       sterilisation, 3. Trockene Hitze: Ausglühen und Abflammen, 3. Chemische Sterilisation: durch Gas Ethylenoxid.

  • Desinfektion: Eine chemische Sterilisation wird fast nur zur schonenden Behandlung hitzeempfindlicher Produkte, meistens deren Oberflächen eingesetzt und fast ausschliesslich mit dem hochgiftigen und explosionsgefährlichem Ethylenoxid - daher fällt dieses Verfahren für den Heimgebrauch weg. Dafür gibt es aber zahlreiche antimikrobiell wirksame chemische Stoffe, meist flüssig, zur Keimreduzierung an Oberflächen. Solche Mittel werden zur Abtötung bzw. Inaktivierung von Keimen an und in kontaminierten Objekten eingesetzt und als Desinfektionsmittel bezeichnet.

       Wichtig. mit Desinfektionsmitteln wird immer "nur" eine Keimreduzierung, niemals eine Sterilisation erreicht! In der Regel wird Keimzahlreduzierung um

       5 Zehnerpotenzen angestrebt, d.h. um 99.999 %​. Die Hitzesterilisation sollte daher, wo immer möglich, bevorzugt eingesetzt werden.

  • Bestrahlung: hohe energiereiche ionisierende Strahlung, primär Gammastrahlung (Info) wirkt sterilisierend. Für den Heimbrauer kommen nur eingekaufte Artikel mit dieser Behandlung in Frage, z.B. sterile Kunststoffpipetten, Membranfilter und vor allem Einweg-Petrischschalen.

  • Sterilfiltration: Steril- oder Entkeimungsfiltration wird durch verschiedene Filtertypen (z.B. Membranfilter, Tiefenfilter) an flüssigen und gasigen Medien erreicht. Membranfilter weisen meist mit einem mittleren Porenduchmesser von 0.2 µm (Mikrometer, 1 µm = 1/1000 mm) auf. Für den hefezüchtenden Brauer kämen nur hitzelabile Nährmdien für die Sterilfiltration in Frage, ist aber i.d.R. zu aufwändig und wird daher mit schonendem Autoklavieren erreicht (reduzierte Autoklavierzeit). Hingegen ist für eine sterile Belüftung der keimfreien Anstellwürze die Sterilfiltration der Begasungsluft sinnvoll.

 
Braulabor 6: Minimaltechniken "Steriles bzw. keimarmes Arbeiten in Heimlabor" 
Die Steriltechniken bzw. Entkeimungstechniken im mikrobiologischen Braulabor haben letztlich alle das Ziel, bierverderbende Fremdkeime (wie Lactobacillii, Pediococci, Acetobacter und Zymomonas spp.) zu verhindern bzw. zu unterdrücken. Steriltechniken verhindern alle Mikroorganismen und infektiöse Partikel, Entkeimungstechniken reduzieren die Zahl der bierverderbenden Keime auf eine nichtschädigende Mindestzahl. Aber: gut zu wissen - In Bier können sich letztlich keine gesundheitsgefährdenden Keime entwickeln!
Unerwünschte Keime werden vor allem durch die Luft ("Luftkeime"), den Menschen selbst und durch unsterile Geräte eingeschleppt. Raumluft enthält normalerweise 500-2'000 Keime/m3, die vorwiegend an Staubpartikeln haften. Deshalb muss das Eindringen, Aufwirbeln und die Ablagerung von Staub im Arbeitsbereich ("Sterilbereich") möglichst verhindert werden. Der menschliche Körper beherbergt zahlreiche vermehrungsfähige Mikroorganismen, ja ganze Lebens-gemeinschaften. Besonders "keimspendend" sind die Mikroflora der Haut und der Haare sowie des Mund- und Nasen-Rachen-Raums (z.B. über Tröpfchen-infektion). 
 
 
Verfahren: 9 verschiedene einfachste Sterilisationstechniken bzw. Entkeimungstechniken
Material: siehe jeweiliges Verfahren
Methoden: Sterilisation/Entkeimung durch trockene und feuchte Hitze, durch Filtration und durch chemische Stoffe.
Ergebnisse: Keimfreie (sterile) bis (keimreduzierte) desinfizierte Objekte.
Minimaltechnik 1: Oberflächen entkeimen - Dekontamination
- zunächst eigene Hände mit einer Flüssigseife gründlich reinigen (Video), bzw. mit einem Desinfektionsmittel behandeln (z.B. Sterillium: Info - gibt es auch in
  kleinen Fläschen)
- Arbeitsoberfläche mit Desinfektionsmittel (z.B. 65% Isopropanol - (CH3)2CHOH, 70% Ethanol [Äthylalkohol, Brennsprit -
  C2H5OH]) kräftig einspritzen und mit frischem, sauberen Kosmetiktüchlein (Linsoft) "verteilend" abwischen. Kommer-
  zielle Desinfektionsmittel: Halades Alco, Info., Desinfektionsmittel   Halades 191, Info).
Minimaltechnik 2: Sterilisation durch trockene Hitze - Ausglühen
- Impföse: Impfösen und Impfnadeln direkt im heissen Saum der Gasflamme schräg bis zur Rotglut eintauchen/ dann
  noch den metallischen Teil des Impfösenhalters 2-3 x drehend durch die heisse Flamme ziehen
- Impföse vor und nach jedem Gebrauch mit Mikroorganismen sofort durch Ausglühen wieder sterilisieren, bevor man sie
  wieder ablegt bzw. an den Aufbewahrungsort zurück legt
- Impföse nach dem Ausglühen -vor dem Einsatz! - nicht ablegen, sonst wird sie durch vorhandene Umgebungskeime
  wieder kontaminiert. Siehe auch PDF-Dokument "Sterilisieren durch Ausglühen einer Impföse"
- Pinzette: die Pinzettenspitze kann kurz in die heisse Flamme gehalten werden; Vorsicht: die metallische Spitze bleibt
  rel. lange heiss. Besser: Flambieren (siehe unten)
Minimaltechnik 3: Sterilisation durch trockene Hitze - Abflammen
- Glas: normales Glas z.B. Glasstab, Drigalski-Spatel eignet sich nicht zum Abflammen!! --> siehe Desinfektion
- Reagenzgläser (RG): die Mündung von RG (z.B. von Schrägagar-Stammkulturen, vor dem Beimpfen oder Überimpfen )
  kann kurz in die heisse Flamme gehalten werden. Vorsicht: Glas bleibt rel. lang heiss und kann im Kontakt mit Flüssig-
  keiten kaputt gehen, bzw. kann Mikroorganismen beim Kontakt abtöten
- Erlenmeyerkolben (EMK): EMK können wie RGs nach dem Öffnen und wieder vor dem Verschliessen am Kolbenhals
  durch Drehen in der Flamme abgeflammt werden. Durch die warme aufsteigende Luft wird eine Kontamination aus
  der Luft erschwert
Minimaltechnik 4: Sterilisation durch trockenen Hitze - Abflammen mit Ethanol (Flambieren, Abb. 13)
- Pinzetten, Drigalskispatel, Löffel, Scheren sowie Glasgeräte (Pasteurpipetten, Glasstäbe) werden zur schnellen
  Sterilisation in reinem unverdünntem 96%igen Ethanol (z.B. Brennsprit) getaucht und durch kurzes Streifen der Flamme 
  abgeflammt. Der Alkohol muss in einem Glasgefäss mit Deckel (z.B. Färbetrog mit Deckel, Info) weg von der Flamme -
  aufbewahrt werden (bei allfälligem Entzünden kann durch rasches Decken des Gefässes das Feuer sofort erstickt 
  werden. Nach den strengen Massstänbden der Steriltechnik in der Medizin gilt Abflammen
  nur als Notbehelf, ist aber für Brauzwecke völlig ausreichend.
Minimaltechnik 5: Sterilisation durch trockene Hitze - Heissluftsterilisation
- Glaspetrischalen/ Glaspipetten/ EMK/ Bierflaschen: solche Glaswaren werden
  prinzipiell in heisser Luft sterilisiert.
  Pipetten: in Alufolie eingewickelt oder in sterilisierbaren Kunststoffbeuteln ("Vernichtungs-
  beutel")
  EMK: mit Verschlusskappen, Alufolienkappe, Wattepropfen mit Alufolie
  Bierflaschen für Kronkorkenverschluss: mit Alufolienkappe abgedeckt - siehe Abb. 7.5
  Bierflaschen mit Bügelverschluss: ohne Gummiring mit Alufolie abgedeckt; Gummiring -->
  siehe chemische Desinfektion
  Sterilisationsbedingungen: trockene Heissluft in geschlossenem Raum (z.B. sauberer Backofen)
  ohne Lufttzufuhr von aussen 20-30 min bei 180 °C - Aufheizzeit (= Anheizzeit + Ausgleichszeit)
  noch dazu rechnen!
Minimaltechnik 6: Sterilisation durch feuchte Hitze - Autoklavieren (Dampf-
                                 sterilisation)
- Kulturmedien (sofern Bestandteile wie z.B. Vitamine durch die Temperatur von ca. 120 °C
  nicht geschädigt werden; flüssige Nährmedien mit und ohna Agarzusatz9
  allg. Flüssigkeiten (z.B. physiologische Kochsalzlösung 0.9% NaCl, pH-Puffer, Milchsäure)
- Instrumente aus Glas und Metall (z.B. Filtergeräte, Gaze, Watte, Glaswaren [sofern sie
  nicht trocken bleiben müssen]
- Schläuche aus Silikon, Stopfen sowie zu vernichtende Mikroorganismen-Kulturen
  (in sterilisierbaren Vernichtungsbeuteln)
  Sterilisationsbedingungen: grundsätzlich bei kleineren Mengen im Haushalts-Dampfdrucktopf
  (Schnellkochtopf) 20 min bei 121 °C, Anheizzeit + Ausgleichszeit noch dazu rechnen:
  Einzelvolumina bis 50 mL: + 5 min //  50-100 mL: + 8 min // 100-500 mL: + 12 min // 
  500-1'000 mL: + 20 min.
Tipps: 
- Autoklav: Ein Autoklav (gr./lat. selbstverschliessend) ist ein gasdicht verschliessbarer Druckbehälter,
  der für die thermische Behandlung von Stoffen im Überdruckbereich eingesetzt wird. Autoklaven
  werden überwiegend in der Medizintechnik und in der Mikrobiologie verwendet. Ein Dampfkochtopf
  (Schnellkochtopf) stellt ebenfalls einen Autoklaven dar und dient daher als kostengünstiger Ersatz-
  autoklav. Einsatz und Bestückung im Heimlabor: auf einer Heizplatte/Kochherd, cf. Abb. 
- Gefässe: maximal 3/4 voll füllen
- Volumina: möglichst nur Volumina gleicher Grössenordnung einbringen - die Dauer der Sterilisation
  richtet sich nach dem grössten Volumina, kleinere Volumina werden einer unnötigen Hitzebelastung
  ausgesetzt (z.B. Vitaminzusätze)
- Verschlüsse: Verschlüsse von Kulturgefässen wie EMK nur lose auflegen, um ein Verdrängen der Luft
  durch Wasserdampf zu ermöglichen und ein Platzen bei Erhitzung oder Abkühlung zu verhindern !!
  Immer mit Alufolie abdecken und wenn möglich mit einem Sterilisationsindikatorstreifen.
- Beschriftung: in "autoklavenfester" Form vornehmen (z.B. durch am Gefäss angebrachte Papierzettel,
  wasserfeste Faserschreiber unter Alufolie geschützt)
- Abkühlzeit: nach Ablauf der Sterilisationszeit im Dampfkochtopf unbedingt warten, bis die Druck-
  anzeige keinen Innenüberdruck mehr anzeigt (i.d.R. beide rote Ringe des Ventils nicht mehr sichtbar).
  Forciertes Druck ablassen oder Abkühlen des Kochtopfes mit kaltem Wasser kann beim Öffnen des
  Kochtopfes zu sehr gefährlichen Siedeverzügen führen!   (Info Siedeverzug). Faustregel: nach Ende
  Sterilisation noch ca. 15 min abwarten, bevor Schnellkochtopf geöffnet wird
- Pipetten, leere Gefässe u.ä.: können wie Kulturmedien sterilisiert werden (15-20 min, 121°C). Nach
  der Sterilisation kann der Dampf schnell abgelassen werden, da keine Flüssigkeiten herausspritzen
  können.
PDF-Dokument: "Keimreduktion ohne Schnellkochtopf (Fast-Sterilisation)"
PDF-Dokument: "Reinigungs-/Desinfektionsmittel nach Einsatzbereichen geordnet"

Abb. 14. Schnellkochtopf als Ersatzautoklav.

Alle zu sterilisierenden Flüssigkeiten inkl. Nährmedien mit Agar müssen in einem Gefäss mit Verschluss sein. Als Abdeckung kön- nen Wattepfropfen mit Alufolie abgedeckt oder mit Alukappen (CAP-Kappen, EMK: Info, RG: Info) dienen. Anstelle von Leitungs-wasser setzt man besser ention. Wasser ein (keine Kalkrückstände).

Wichtig: erst wenn beide roten Ringe des Ventils sichtbar sind, startet die Sterilisationsphase mit 121°C.

Abb. 12. Ausglühen in der Gasbren-nerflamme ist eine schnelle und zuverlässige Sterilisationsmethode. Temperaturen von über 1000 °C töten alle Mikroorganismen in Bruchteilen

von Sekunden ab.

Abb. 11 A. Luftfangplatte (Nähragar, 10 min an der Luft exponiert). Mikroorganismen, hier fast ausschliesslich Bakterienkolonien sichtbar, sind überall, auch in der Luft. Luftkeime sind häufig pigmentiert (z.B. Carotinoide - gelb, rot, purpur-farben) als Schutz gegen ultraviolettes Licht. 

Abb. 11 B. Luftfangplatte (Malzagar, 10 min offen).  Hier sind primär Pilzkolonien (wattig), Bakterien- und Hefekolonien* gewachsen. 

*: können nur lichtmikroskopisch von Bakterienkolonien differenziert werden.

Braulabor: Experimentieranleitung zu "Luftfangplatten

Abb. 11 C. Nähragarplatte mit Fingerabdrücken. 

Linke Petrischalenhälfte: Abklatsch zweier mit Seife gewaschenen Fingerspitzen. 

Rechte Hälfte: ungewaschene Fingerspitzen. Das para-doxe Ergebnis erklärt sich aus der Tatsache, dass beim Waschen auf der Haut gewachsene Mikrokolonien zerrieben werden und dadurch mehr Mikrokolonien

auf dem Nähragar wachsen. Die Gesamtzahl der Keime hat beim Waschen natürlich trotzdem abgenommen! 

Abb. 13. Flambieren: Abflammen eines Glasspatels (Drigalski-Spatel) mit Ethanol abs.

Oben: Drigalski-Glasspatel zum Verteilen von Hefezellen wird zu- nächst in einer Wanne in Ethanol abs. (z.B. Brennsprit) eingetaucht; Malzagar-Petrischale und Schrägagarröhrchen mit Hefezellen sowie Impfösen und Gasbrenner sind bereit gestellt. Der mit Ethanol ge- tränkte Drigalskispatel wird in die Nähe der Gasflamme gehalten.

Unten: Der Glasspatel wird kurz durchs Feuer gezogen und fängt so Feuer (Dunkelaufnahme: Gasbrennerflamme ganz rechts und flambierter Glasspatel links.

 
 
Minimaltechnik 7: Sterilisation durch Filtration - Sterilfiltration
Die Sterilfiltration kann bei Lösungen und Flüssigkeiten eingesetzt werden, die durch Hitze geschädigt werden (z.B. Vitamine, Zuckerarten, Enzyme u.a.). Die dazu verwendeten Filter sind sog. Membranfilter, poröse, etwa 0.1 mm dicke Schichten. Die Porengrösse variiertr von einigen Mikrometern bis zur Grössenordnung von Molekülen. Zur Sterilisation von Flüssigkeiten und Gasen (z.B. Luft) wird eine Porengrösse von 0.22 bis 0.45 Mikrometer [µm] eingesetzt.
Der Heimbrauer wird diese Sterilfiltrationstechnik eigentlich nur im Brauprozess beim Belüften der Anstellwürze benutzen.
Vorgehen:
- zunächst sterilisierbaren Schlauch (Silikonschlauch) mit Würzebelüftungsstein aus Edelstahl (Info) am
  einen Ende befestigt im Dampfkochtopf 15 min, 121°C.  autoklavieren. Tipp: am einfachsten gleich mit
  Sterilfilter in Vernichtungsbeutel autoklavieren
- sterilen Luftfilter 0.2 µm (Info) mit Aquarienpumpe und dem Sterilschlauch mit Belüftungsstein in der
  richtigen Orientierung ankoppeln (Elemente der
  "Belüftungskette": 1 Aquariumpumpe - 2 Verbindungsschlauchstück zum Sterilfilter - 3 Sterilfilter
  (gelber Teil des Sterilfilters mit grosser Öffnung in Richtung Luftpumpe, kleine Öffnung mit Schlauch
  Richtung Belüftungsstein verbinden!)  -  4 Schlauchstück zum Belüftungsstein - Würzebelüftungsstein
  - Anstellwürze im Gärtank)
- die sterilen Endteil des Belüftungsschlauches mit Belüftungsstein wird in die abgekühlte Anstellwürze
  im Gärbehälter eingeführt und dann mit der Belüftung   begonnen (5-15 min, siehe  "Brauprozesse
  mit Braumeister, Pkt. 7).

Abb. 15. Sterilfiltration von empfindlichen Flüssig-keiten. Spritze mit aufgesetztem Sterilfilter.

Abb. 16. Belüftungseinrichtung für Anstellwürze.

Aquarienpumpe --> Sterilfilter 0.2 µm (gelbe weite Öffnung --> kleine Öffnung)

--> Schlauch --> Belüftungsstein.

Die auf dem Vernichtungsbeutel liegende Teile müssen steril sein, d.h. autoklaviert

werden. Der Sterilfilter wird steril verpackt geliefert und kann mehrfach - sofern er beim Autoklavieren im Vernichtungsbeutel trocken bleibt - verwendet werden.

Minimaltechnik 8: Sterilisations-  resp. chemische Desinfektionsverfahren - Desinfektion/Keimreduzierung durch chemische Mittel
Chemische Verfahren führen selten zur Sterilisation im Sinne von Abtöten aller Mikroorganismen inkl. Bakteriensporen (Typus Endospore). Zahlreiche antimikrobiell wirksame Stoffe, meist in flüssiger Zubereitung, werden zur Keimverminderung eingesetzt. Diese Desinfektionsmitel töten selektiv Keime bzw. inaktivieren unumkehrbar Keime an und in keimbeladenen Objekten, meist Oberflächen. Diese Keimreduzierung ist weniger wirksam als eine Sterilisation, deshalb ist eine Hitzesterilisation wann immer möglich zu bevorzugen! Die sog. Gebrauchsverdünnungen sind möglichst unmittelbar vor dem Einsatz mit reinem Wasser (z.B. deionisiertem Wasser) anzusetzen. In der Regel sollte man Mittel für 1. Händedesinfektion, 2. Flächendesinfektion, und 3. Gerätedesinfektion unterscheiden. Im Folgenden wird eine kleine Auswahl präsentierter chemischer Mittel vorgeschlagen. Gute Infoquelle: Hygienewissen.
Vorgehen:
- Mittelauswahl passend zum Objekt: 1. Händedesinfektion --> Sterillium (Info); 2. Flächendesinfektion --> 70%iges Ethanol
  (in Spritzflasche), 60-65%iges 2-Propanol (Isopropylalkohol, C2H7OH); 3. Gerätedesinfektion: siehe Liste *Desinfektionsmittel"
- Händedesinfektion:
  1. mit normaler Seife bzw. antimikrobieller Seife Hände vorwaschen (Info) --> 60-80% bzw. 80-90% der mehrerer Tausend
      Keime/cm2 bereits abgewaschen
  2. 2- 3-mal ca. 3 mL Sterillium in die hohle Hand geben und mindestens jeweils 30 s lang alle Partien der Hände einreiben; 
      Hände dürfen dabei nicht trocken werden (Details: sehr lesenswerte Info)
  3. Nach Arbeitsende mindestens nochmals mit antimikrobieller Seife Hände waschen.
- Flächendesinfektion:
  vor jedem Arbeiten gründlich mit 70%igem (v/v) Ethanol (Brennsprit) aus einer Spritzflasche kräftig abspritzen und mit dem
  zweiten aus der Kartonbox gezupftem Kosmetiktüchlein (Zellstofftüchlein, auch Wattebausch geeignet)
  abwischen
- anstelle von Alkohol können auch kommerzielle Desinfektionsmittel eingesetzt werden, z.B. Meliseptol rapid (Info).

Abb. 17. Weitverbreitetes Händedesinfektionsmittel.

Einsatz vorzugsweise nach Händewaschen mit Seife.

Abb. 18. Flächendesinfektion. Die Arbeitsfläche wird kräftig mit Alkohol eingespritzt und mit einem frischen Zellstoff-tüchlein "reinigend" auf der Oberfläche verteilt.

[Quelle: Lammert, Techniques in Microbiology, Pearson, 2007].

- Objekt-/ Gerätedesinfektion:
  Unter "Objekt" bzw. "Geräte" fallen z.B. Braukessel, Gärbehälter, Aufbewahrungsbehälter aus Kunststoff (z.B. für Bierwürze), Kegs, Schläuche, Abfüllsysteme,
  Abfüllrohre, Siebe (z.B. Milchsieb Info), gewisse Messinstrumente (z.B. Tilt Hydrometer Info), wiedereinsetzbare Pipetten, u.a. Gemeinsam allen diesen Gegen-
  ständen ist es, dass sie eine möglichste keimarme Oberfläche im Kontakt mit dem Bier (Bierwürze, Bier in Gärphase, Jungbier, Bier im Keg etc.) haben sollten
Vorgehen:
- Verschmutzungsart und Verschmutzungsgrad bestimmen
- evtl. zunächst mechanisch vorreinigen
- zum jeweiligen Objekt das passende Desinfektionsmittel auswählen (cf. Liste
  "Desinfektionsmittel")
- gemäss den Angaben auf dem Desinfektionsmittel das Desinfektionsmedium
  jeweils frisch herstellen
- gemäss den Angaben des Herstellers jeweils die Objekte der entsprechenden
  empfohlenen Desinfektionsdauer, je nach Verfahrensmethode (Oberfläche 
  ansprühen, Desinfektionsbad), einwirken lassen
- u.U. mit sterilem Wasser abspülen
- evtl. Nachbehandlung
Beispiel 1: Chemipro OXI -  ein ​ak­tiv­sau­er­stoff­hal­ti­ger Reiniger    (Info)
- Bsp. Speidel Kunststoff Gärfass aus PE, nach Primärgärung: Verschmutzungsgrad
  stark, Verschmutzungsart organisch
- Reinigung: mechanisch mit Bürste (z.B. Kegelbürste Vikan, Fass- und Pfannen-
  bürste Vikan, Info) und Haushalt-Geschirrspülmittel (Palmolive antibakteriell,
  Held eco Geschirrspülmittel)
- Chemipro OXI: Multifunktionsreiniger für alle leicht beschmutzten Materialien, mit
  aktivem Sauerstoff (Natriumkarbonat Peroxyhydrat). 4 g/L warmes Wasser, 5-30 min einwirken
  lassen (Fass liegend am Boden, periodisch rollen, damit gesamte innere Oberfläche in Kontakt mit
  Chemipro OXI kommt).
- Ausspülen mit   Leitungswasser und anschliessend mit entionisiertem Wasser aus Spritzflasche
  Anmerkungen: Unter Gebrauchsanweisung wird Kontaktzeit von nur 2-5 min angegeben, Nachspülen nach gutem
  Abtropfen nicht nötig --> da es aber oft noch kleine weisse Chemipro OXI-Perlen am Boden, ist Nachspülen wohl besser. 
- innere Oberfläche mit 70%igem Isopropanol absprühen und Gefäss bis zum nächsten Einsatz gut schliessen.
Beispiel 2: ten­sid­hal­ti­ger Spezialreiniger wie Star San HB Five Star   - stark schäumender, saurer anionischer
  Klarspüler (Info)
- Bsp. Speidels Braumeister nach Sud: Verschmutzungsgrad stark, Verschmutzungsart organisch, anorganisch
  (Bierstein)
Reinigung: mechanisch mit Bürste (z.B. Kegelbürste Vikan, Fass- und Pfannenbürste Vikan, Info), Cellulose-Soft-
  Scheuerschwamm und Haushalt-Geschirrspülmittel (Palmolive antibakteriell), Held eco Geschirrspülmittel)
- bei starker "Verkrustung" der Braumeister-Heizschlange: mit Halapur MP (alkalisches Reinigungs- und Desin-
  fektionsmittel [Na-metasilikat, Na-phosphat, Soda, Chlorträger], Info), 0.5% (5 g/1 L 50-75 °C warmes  Wasser)
  30-60 min einwirken lassen, dann mit sanftem Scheuerschwamm abscheuern
- Ausspülen mit reichlich Leitungswasser (insbes. nach Behandlung mit chlorhaltigen Reinigungsmitteln)
- kräftiges Einsprühen von Isopropanol 70% und abdecken der Öffnungen im Suddeckel mit Alufolie.
Beispiel 3: Isopropanol 70%  (Info)
Isopropylalkohol gehört zu den alkoholischen Wirkstoffen der Gruppe aseptische Mittel.
Unverdünnt wirkt er lediglich keimhemmend (Sporen überleben, da diese erst mit Wasser aus-
keimen und dann von Isopropanol "attackiert" werden können). Mit Wasser zu einer mindestens
50-prozentigen Lösung verdünnt, hat er einen keimtötenden Effekt auf Bakterien und Pilze. Die
Mischung löst ihre Zellmembranen an und zerstört Enzyme, welche für die Krankheitserreger
lebenswichtig sind. Einsatzbereich 65-70%ig.
- Bsp. 1: Innere Oberflächen (z.B. von Gärbehältern, Kunststoffbehälter, Flaschen, u.a.): mit
  Isopropanol aus einer Zerstäuberflasche reichlich besprühen und Gefässe nachher gut
  schliessen; Behälter evtl. mehrfach Drehen zur guten Benetzung der gesamten inneren
  Oberflächen.
- Bsp. 2: Abfüllpistolen, Abfüllrohre, BeerGun-Abfüllpistole, Tilt-Hydrometer. Abfüllpistolen
  reichlich ansprühen; Abfüllrohre/BeerGun in z.B. Messzylinder mit Isopropanol gefüllt jeweils
  eintauchen (Abb. 20); Tilt: in mit Isopropanol gefüllten Behälter "schwimmen" lassen, dann mit
  ebenfalls in Isopropanol entkeimter Pinzette in Gärbehälter transferieren (Abb. 21).
- Bsp. 3: Kronkorken in Isopropanol (oder Ethanol 70%) einlegen, so dass sie vollständig mit dem
  Alkohol bedeckt sind; mit einer ebenfalls an der Spitze eingelegten Pinzette unmittelbar vor dem
  Verschliessen mit einem Kronkorkapparat auf die sterile Bierflasche platzieren und verschliessen.
PDF-Dokument: "Reinigungs-/Desinfektionsmittel nach Einsatzbereichen geordnet"

Abb. 19. Ein Grundstock an nützlichen Desinfektions-/Reinigungsmittel.

Isopropanol (Propan-2-ol, 70%ig in Zerstäuberflasche), Halapur MP, Chemiepro OXI, Star San HB + PBW.

Abb. 20. Entkeimung von Abfüllsystemen

(z.B. BeerGun [vorne Mitte], automatischer Heber [hinten links] u.a.).       Video BeerGun.

Die über eine CO2-Gasflasche und Keg- Behälter gekoppelte Abfüllpistole BeerGun (Details: cf. Brauprozesse im Bild, Abb. 7.9) taucht in einen 1L-Messzylinder ein, der mit z.B. einer Chemipro OXI-Lösung oder mit 70%igem Ethanol bzw. Isopropanol gefüllt ist. 

Abb. 21. Entkeimung des Tilt-Hydrometers vor dem Ein- satz in der Anstellwürze. Links: Tilt-Hydrometer mit Pinzette umfassen, Messbecher mit Ethanol 70% gefüllt.  Rechts: Tilt-Hydrometer vollständig eingetaucht im Ethanol, Pinzette bleibt daran --> damit kann der Hydrometer nach der Entkeimung direkt in den Gärbehälter mit der sterilen Anstellwürze beför-dert werden.

Abb. 22. Desinfektion der Kronkorken unmittelbar vor dem Verschluss der Bierflaschen.

Von links nach rechts: Kronenverkorker mit Bierflasche und aufgesetztem entkeim-tem Kronkorken, Alkoholbad (Ethanol 70% oder Isopropanol 70%) mit eingetauchter Pinzette und Kronkorken, Behält-er mit Desinfektionsmittel Ethanol 70%, sterile Bier-flaschen mit Alufolienkappe, die kurz vor dem Abfüllen des Bieres entfernt wird.

Weitere Minimaltechniken 9: Sterilisation durch Bestrahlung

Von den zur Entkeimung bzw. Teilentkeimung gebräuchlichen Strahlungen (Ultraviolett (UV)-Strahlung, Röntgenstrahlung, Gammastrahlung, Mikrowellen) kommen im Braulabor nur gerade den Mikrowellen eine minimale Bedeutung zu.

Küchen-Mikrowellengeräte (700-900 Watt Mikrowellen-Leistung) eignen sich höchstens für rasche Sterilisationen geringer Quantitäten ausgewählter Gegen-stände wie leere Petrischalen aus Glas, gereinigte gebrauchte Einweg-Kunststoffartikel wie Petrischalen und Plastikspritzen (ohne Metallkanülen!) für den Wiedergebrauch.

Weitere Einsatzmöglichkeiten sind: Dekontamination unsteriler Petrischalen mit Nährmedium (z.B. durch unbeabsichtigtes Öffnen, unvollständiges oder unkorrektes Autoklavieren, für Langzeitlagerung etc.), kleine Flüssigkeitsmengen (50-100 mL) z.B. physiologische Kochsalzlösungen oder Puffer für Verdün-nungsreihen. Ungeeignet für die Sterilisation von Agarmedien!

Vorgehen:

- Petrischalen: maximal 5-10 Stück anfeuchten, 10 min bei maximaler Leistung

- Recycling von Kunststoffartikeln wie Einweg-Petrischalen und -Spritzen: anfeuchten, 10 min bei max. Leistung, unbedingt Kanülen der Spritzen entfernen

  (vgl. Betriebsvorschriften des Gerätes!)

- Dekontamination von unsteril gewordenen Nährböden in Petrischalen: max. 5 Petrischalen, 10-15 min (Vorsicht vor Sieden des Agars!)

- weitere Einsatzmöglichkeiten: rasches Aufweichen von kalten, sterilen Agarmedien (Vorräte), rasches Erhitzen von kleineren Flüssigkeitsmengen zur Keim-

  abtötung, Auftau von gefrorenen sterilen Flüssigkeitsmengen.

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Abb. 23A. Wichtige autoklavierbare Kulturgefässe zur Hefeanzucht und Haltung.

Von links nach rechts: Erlenmeyerkolben [EMK], Erlenmeyerkolben mit Schikanen [SEMK] (Einbuchtungen), Becherglas, Reagenzglas ohne Rand, Petrischalen (Kunststoff: strahlen-sterilisiert).

Abb. 23B. Hefeanzuchtgefässe.

Links: Hefeflasche 500 mL (autoklavier- bar), rechts: Hefebox mit Ventil, 1.4 L.

2. Grundlagen: Nährmedien für Hefen und Bakterien
2.1. Einführung
Die Mikroorganismen wie Hefen oder Bakterien erhalten die notwendigen Nährstoffe für Wachstum und Vermehrung mit dem Nährmedium bzw. Kultur-medium, in dem sie wachsen.
Zusammensetzung der Nährmedien:
- Wasser:  Leitungswasser oder, bei genau definierten Nährmedien, entionisiertes Wasser (auch besser geeignet für die Sterilisation)
- Energiequelle:  meist eine organische Verbindung, z.B. Kohlenhydrate wie Zucker
- Kohlenstoffquelle: meist ein Kohlenhydrat, aner auch Eiweisshydrolysate ("verdaute Eiweissstückchen") oder Fettsäuren.
- Salze: Makroelemente wie Stickstoff, Phosphor und Schwefel sowie Metalle und Spurenelemente in Form von Salzverbindungen.
- zusätzliche Stoffe: wie z.B. Vitamine, Hormone, evtl. pH-Puffer (z.B. Phosphatpuffer)
Arten von Nährmedien: meist komplexe oder Komplettmedien, aus natürlichen Materialien mit einer Vielzahl von nicht genau erfassten und charakterisierten Stoffen. Bsp. Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton (hydrolysiertes Protein). Nach dem Aggregatszustand werden
- Flüssigmedien: häufig zur Anreicherung von Mikroorganismen (--> Anstellhefe), und
- Festmedien: enthalten das Geliermittel Agar, vor allem zur Isolierung von Mikroorganismen, Untersuchung ihrer Eigenschaften oder zur mittelfristigen
   Stammhaltung (z.B. auf Schrägagar-Röhrchen) unterschieden.
Braulabor 7: Nährmedienrezepte für Hefen und Bakterien
2.2. Nährmedien für Hefen 
Im Folgenden werden zwei Standardnährmedien für Flüssigkulturen vorgestellt (M1, M2)     Abk. TME Trockenmalzextrakt rein, RG Reagenzglas, EMK Erlenmeyerkolben
sowie 3 Flüssigmedien zur Anzucht und Vermehrung (M3, M4, M5)
M1:  Startermedium für die Anstellwürze nach dem Sud:
  •    - x g Malzextrakt standard (z.B. ROTH X976.1) oder helles Brau-Malzextrakt trocken (TME, [Info, Info]) --> OG (Original Gravity) zwischen 1.030 bis 1.040
  •      (= 7 - 10 °P)
  •      bzw. anpassen an Anstellwürze-OG/bzw. ausgewähltem Bierrezept.
  •      Faustregel: 10 - 12g Malzextrakt pro 100 mL Starterwürze (= 1 g TME/10 mL Starterwürze. Durch Zugabe von reiner Maltose (schwierig zu
  •      beschaffen, z.B. Info) kann der OG-Wert beeinflusst werden. Nur Maltose -Zucker induziert Bildung des Enzyms Maltase zur Maltosespaltung!
  •   - 1.0 g Wyeast Hefe Nutrient Blend (Info, Info) oder White Labs Yeast Nutrient WLN1000 (Info) [enthalten z.B. Ammoniumphosphat (NH4)3PO4, Vitamine,
  •      Proteine und Mineralstoffe]
  •   - 1 Tropfen Hopfenextrakt oder ca. 1/10 Hopfenpellet (kann auch weggelassen werden bei steriler Arbeitstechnik)
  •   - ad 100 mL Wasser (dest. oder entionisiert)
  •    - pH auf 4.7 plus/minus 0.2 einstellen*
M2: Malz-Anzuchtmedium für Schrägagar-Hefestammkulturen  ("Würzeschrägagarkulturen"):
        - 1.9 g Malzextrakt-Bouillon (z.B. ROTH CP75.1, Datenblatt)
​      - Zusatz an Hefenährsalze und Hefe-Nährstoffe
           (z.B.  Wyeast Hefe Nutrient Blend (Info, Info) oder
           White Labs Yeast Nutrient WLN1000 (Info, Info)
           je <0.1 g/100 mL)
        - ad 100 mL Wasser (dest. oder entionisiert)
        - pH auf 4.7 plus/minus 0.2 einstellen*
M3: Malz-Festmedium  für Schrägagarkulturen/Malzagarplatten:
         - 3.36 g Malzextrakt-Agar (z.B. ROTH X923.1, Datenblatt)
         - 1.3 g Maltose
         - 0.25 g (NH4)H2PO4 oder 0.1 g K2HPO4 + 0.1 g NH4Cl
         - ad 100 mL Wasser (dest. oder entionisiert)
         - pH auf 4.7 plus/minus 0.2 einstellen*
         oder
 M4: - 4.0 g Malzextrakt standard (z.B. ROTH X976.1, Datenblatt)
         - 1.3 g Maltose
         - 0.25 g (NH4)H2PO4 oder 0.1 g K2HPO4 + 0.1 g NH4Cl
         - 1.5 g Agar-Agar (Info, oder Agar-Agar ["pflanzliches Geliermittel"] aus einem Reformhaus (z.B. Info))
         - ad 100 mL Wasser (dest. oder entionisiert)
         - pH auf 4.7 plus/minus 0.2 einstellen*
oder
 M5: - 1.5 g Malzextrakt standard (z.B. ROTH X976.1Datenblatt)
         - 0.08 g Mischpepton 
         - 1.3 g Maltose
         - 0.3 g Dextrin 
         - 0.25 g (NH4)H2PO4 oder 0.1 g K2HPO4 + 0.1 g NH4Cl
         - 0.24 g Glycerin
         - 2.0 g Agar-Agar  --> ohne Agar ergibt sich eine Würzebouillon!
         - ad 100 mL Wasser (dest. oder entionisiert)
         - pH auf 4.7 plus/minus 0.2 einstellen*
 
Hinweise/ Vereinfachungen: 
Anstelle der "professionellen" (und teureren) aufgeführten Malzprodukte kann 1. das beim Heimbrau-Fachhändler erhältliche übliche trockene Malzextrakt-pulver (TME) verwendet werden (z.B. Info), z.B. 10-12 g/100 mL. 2. Auch Ausschlagwürze von ca. 8% mit etwas mehr Agarpulver (1.5-2.0 g/100 mL) kann als Hefenährboden (= Würzeagar) eingesetzt werden.
 
*pH-Wert-Einstellung: nach der Sterilisation und Abkühlung auf etwa 50°C eine vorher bestimmte Menge an steriler Säure zugeben (z.B. 10%ige Milchsäure). Diese genau dosierte Säuremenge wird vorher einmal mit jedem der Nährmedien bestimmt: entsprechendes Nährmedium sterilisieren, dann auf  gewünschten pH-Wert bringen, die dabei benötigte Säuremenge pro Nährmediumeinheit (z.B. 100 mL) protokollieren.
Alternative: dem Nährbodengemisch 0.2% di-Natrium- oder di-Kaliumhydrogenphosphat (0.2 g/100 mL Na2HPO4 resp. K2HPO4) zusetzen.
Zusatzstoff "Hefenahrung/Hefenährstoffe": Ergänzung der  verschiedenen Hefe-Nährmedien zur Vorbeugung von Gärproblemen.
Unter "Hefenahrung" (engl. nutritional yeast supplement) wird eine Mischung aus Vitaminen, Mineralien, Aminosäuren, Zink und anderen Spurenelementen verstanden (Info), die für eine schnelle und vollständige Gärung vorteilhaft sind. Führende Hefeproduzenten wie Wyeast, White Labs oder Fermentis führen ähnliche Produkte in ihrem Sortiment an (Wyeast Nutrient Blend, White Labs Servomyces, White Labs Yeast nutrient
Als Vorteile der Hefezusätze werden angepriesen: schnelleres Ankommen, Verkürzung der Gärzeiten, Unterstützung dss Flockungsvermögens (Flokkulation), Verringerung der unangenehmen schwefligen Fehlaroma, Verbesserung der Hefegesundheit und der Viabilität, Reduktion der Diacetylbildung gegen Ende der Hauptgärung, Steigerung des Vergärungsgrads, Verbesserung der Hefeproduktion/Hefevermehrung sowie der Qualität des Endprodukts.
Empfehlenswerte Zugaben: Starternährlösungen, gegen Ende des Suds (Anstellwürze), allgemein Nährmedien. Dosierung: wenig, Angaben der verschiedenen Produkte beachten (Bsp. Wyeast-Beer Nutrient Blend: 2.2 g für 19-L-Würze.
 
2.3. Nährmedien für ausgewählte Bakterienstämme
2.3.1. Einführung in Fremdmikroorganismen
Mikroorganismen im Bier können erwünscht oder auch (meist) unerwünscht sein. Zu den erwünschten Bakterien gehören beispielsweise die Milchsäure-bakterien (zur biologischen Säuerung, für bestimmte Biersorten wie Berliner Weisse, Gose, belgische Lambic-Biere, belgische Fruchtbiere, allgemein für Sauer-biere [engl. sour beer, Info]).
Zu den unerwünschten gehören alle Bakterien und andere Mikroorganismen, die als Kontaminanten das Bier verderben. Bier ist alkoholhaltig und daher grundsätzlich nicht sehr anfällig für mikrobiellen Verderb. Weiterhin verhindern die Hopfeninhaltsstoffe wie trans-Isohumulon mit z.T. antibiotisch wirken-den Eigenschaften, der eher niedrige pH-Wert (um 4.5 herum), der hohe CO2-Gehalt, das niedrige Redoxpotenzial und die geringe Konzentration an Nährstoffen allzu gute Wachstumsbedingungen für Kontaminanten. Pathogene Keime wie z.B. Salmonellen oder Shigellen (Info) haben keine Überlebens-chancen im Bier. Die Bakterien aber, die trotzdem noch im Bier wachsen können, sind aber apathogen, stellen also für die menschliche Gesundheit kein Problem dar. Aber sie können unerwünschte Geschmacks- und Geruchsänderungen sowie optische Beeinträchtigungen (Trübung, Bodensatz) verursachen.
Die mikrobiellen Bierschädlinge können in drei Kategorien eingeteilt werden:
  1. Obligat bierschädliche Bakterien, die immer zum Verderb des Bieres führen (--> Bodensatz, Trübung, Stoffwechselprodukte, Geruchs- und Geschmacks-änderung). Dazu gehören u.a. Vertreter der
       - Lactobacillus brevis --> trübes und saures Bier​
       - Pediococcus damnosus  (Biersarcinen) sind grampositive Streptokokken, die einen buttrigen Biergeschmack verursachen (Diacetylbildung, Info)
       - Pectinatus sp. sind  gramnegative, streng anaerobe, bewegliche Stäbchen, die während ihres Wachstums Essigsäure, Propionsäure und Schwefelwasser-
         stoff bilden. Durch diese Substanzen wird Bier getrübt und weist einen unsauberen Geruch sowie einen fauligen Geschmack auf. Bereits wenige dieser
         Bakterien pro Flasche genügen um Bier zu verderben.
       - Megasphaera sp. sind gramnegative Kokken, obligat anaerob und bilden verschiedenste unerwünschte Säuren wie z.B. Buttersäure und Capronsäure
   
     2. Potenziell bierschädliche Mikroorganismen können nur bei für sie günstigen Bedingungen wachsen, d.h. niedriger Alkohol- und Hopfengehalt, hoher
         Sauerstoffgehalt oder bei erhöhtem pH-Wert. Zu diesen "Opportunisten" gehören verschiedene Milchsäurebakterien und ebenso Fremdhefen wie
         Saccharomyces diastaticus (Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus). Saccharomyces diastaticus zählt zu den übervergärenden Schadhefen, d.h. diese
         Hefe nutzt Nährstoffe (Dextrine, Melobiose), die nach der Vergärung durch die Nutzhefen Saccharomyces cerevisiae übrig bleiben. Das Bier wird trüb und
         bekommt ein typisches Fehlaroma. Oftmals entsteht ein hoher Druck, der die Flaschen zum sogenannten Gushing führt (Info).
         Weitere Schädlinge: Leuconostoc, Streptococcus, Essigsäurebakterien, Kahmhefen, Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis, Micrococcus kristinae, Zymo-
         monas mobilis, Saccharomyces pastorianus.
     3. Indirekt bierschädliche Mikroorganismen können nicht im Bier direkt wachsen, aber sie können Rohstoffe, Vorprodukte und Produktionshilfsmittel
         kontaminieren und dadurch ebenfalls Geschmacksfehler verursachen.
Weitere Einteilung von Fremdkeimen können die Vielfalt der "Bierflora" übersichtlicher machen:
    ​4. Indikatorkeime  zeigen mangelnde Hygiene oder fehlerhafte Reinigung und Desinfektion an. Indikatorkeime können sich im Bier nicht vermehren, sind
        aber häufig mit Bierschädlingen vergesellschaftet. Bsp.: Essigsäurebakterien: Acetobacter pasteurianus, Gluconobacter; Klebsiella pneumoniae; Kulturhefe im
        Filtrat.
     5. Harmlose Begleitflora: das sind Mikroorganismen, die im Bier nachzuweisen sind, aber kaum Veränderungen in Stoffwechselprodukten, Geschmacks-
         oder Geruchsstoffen verursachen. Diese Mikroorganismen können sich zwar im Bier vermehren, aber sie sterben während der Gärung ab. Es sind
         ubiquitäre* Organismen (z.B. Abb. 24) und können auch als Indikatoren mangelnder Hygiene gesehen werden. Bsp.: Micrococcus, Clostridien, Bacillus-
         arten, Enterobacteriaceen, Escherichia, Brettanomyces, Rhodotorula.
     6. Fremdhefen: solche entsprechen nicht dem eingesetzten Kulturstamm und können auch durch Infektion von Wildhefen ins Bier gelangt sein.
          Fremdhefen hönnen Alkohol als C-Quelle verwerten und unerwünschte Aromastoffe bildet. Bsp.: Saccharomyces-Fremdhefen (--> schwierig zu differen-             zieren) und Nicht-Saccharomyces-Fremdhefen.
Infektionswege des Bieres
  • Brauprozesse (Produktion): Durch verunreinigte Rohstoffe wie Malz, Würze, Hefe, Hopfen, Wasser, Zusatzstoffe und Produktionshilfsmittel gelangen die sog. Primärkontaminanten ins Bier.
  • Abfüllung: an schwer zu reinigenden Stellen wie Gärbehälter, Schläuche, Abfüllsysteme, Bierflaschen mit können sich Stellen bilden, wo sich Mikro-organismen halten können (Biofilme). Auch aus der Luft können beim Abfüllen solche Sekundärkontaminanten ins Bier gelangen.
 
Besonders gefährdete Biersorten
Grundsätzlich kann jede Biersorte befallen werden. Anfälliger sind aber alkoholfreie und alkoholarme Biere, schwach gehopfte Biere wie Weizenbiere oder Fruchtbiere. Da der Heimbrauer seine Biere weder pasteurisiert noch steril filtriert, muss er auf besondere Sauberkeit und keimreduzierende Mass-nahmen achten (1. Stufe: reinigen - mechanisch mit Bürsten/Scheuerschwämme und chemisch mit Reinigungsmitteln, 2. Stufe: Keimzahl reduzieren, 3. Stufe: Sterilisieren; siehe: Braulabor 6, sowie Objekt-/Gerätedesinfektion, Liste "Reinigungs-/Desinfektionsmittel nach Einsatzbereichen geordnet").
Nachweis von Bierschädlingen
Kommerzielle grössere Brauereien haben natürlich heute verschiedenste Nachweismöglichkeiten, klassisch mittels spezifischen Nährbodenplatten (--> Resultate erst nach einer Inkubationszeit von mehreren Tagen) oder mittels neuerer DNA*-nachweisender PCR*-Analysen (--> Resultate nach wenigen Stunden, Info). 
Für den Heimbrauer bleiben infolge begrenzter finanzieller Möglichkeiten nur klassische mikrobielle Nachweisverfahren übrig: Wachstumsnachweis auf speziellen Kulturmedien, Keimzahlbestimmung, Einzelkolonien.
Ausführliche Infos zur "bierischen Mikrobiologie": Microbiology of Malting and Brewing, Info (Video), Videos, Fachbuch (engl.) Online-Version; Bierverderber (engl.). Bohak, I., Merkmale und Taxonomie brauereispezifischer Laktobazillen, Diss (2015)
2.3.2. Nährmedien für bakterielle Mikroorganismen
Nährmedium für erwünschte Lactobazillen: MRS-Bouillon  Rezept 1  (Info, Info, Datenblatt)
  •    - 1.0 g Pepton  (Info)
  •    - 0.4 g Hefeextrakt  (Info)
  •    - 0.8 g Rindfleischextrakt
  •    - 2 g Glucose  C6H12O6
  •    - 0.2 g Dikaliumphosphat  K2HPO4 
  •    - 0.2 g Ammoniumcitrat  (NH4)3(C6H5O7)
  •    - 0.02 g Magnesiumsulfat MgSO4
  •    - 0.005 g Mangansulfat MnSO4
  •    - 0.1 g Tween  C58H114O26 (Info)
  •    - 0.5 g Natriumacetat  Na(CH3COO) · 3 H2O
  •    - ad 100 mL Wasser (dest. oder entionisiert)
  •     - pH auf 6.2 plus/minus 0.2 einstellen
  •  
  • Zubereitung:
     Dies sind Medien mit niedriger Selektivität und für die Kultivierung und Isolierung von Lactobacillus
     species bestimmt.
     MRS Supplements: 10 % (w/v) Tween 80 und 30 % (w/v) Natriumacetat in deionisiertem Wasser lösen. 
     Herstellung des Mediums: 5.0 g der MRS-Bouillon-Basis werden in 1 L destilliertem Wasser suspendiert. 10 ml des MRS Supplements (vor Gebrauch gut
     schütteln um gleichmässige Mischung zu gewährleisten!) zugeben und vorsichtig erhitzen bis das Medium vollständig gelöst ist. Das Medium im Schnell-
     kochtopf bei 121°C für 15 Minuten sterilisieren. Das fertige Medium wird lichtgeschützt bei RT gelagert.
Nährmedium für erwünschte Lactobazillen: MRS-Bouillon  Rezept 2       bzw. Festes Nährmedium für erwünschte Lactobazillen: MRS-Agar  Rezept 3
  •    - 5.2 g MRS-Bouillon (Info)                                                                                  - 5.2 g MRS-Bouillon (Info)  
  •    - ad 100 mL Wasser (dest. oder entionisiert)                                                  - 1.7 g Agar-Agar (Info, oder Agar-Agar aus einem Reformhaus (z.B. Info, Info)
  •    - pH auf 6.2 plus/minus 0.2 einstellen                                                              - ad 100 mL Wasser (dest. oder entionisiert)
  •                                                                                                   - pH auf 6.2 plus/minus 0.2 einstellen
  • Zubereitung:                                                                                                            
  • 5.2 g MRS-Bouillon (Rezept 3: 1.7 g Agar) pro 100 mL Wasser suspendieren und gut durchmischen. Langsam erhitzen, um Medium gut zu lösen. In auto-klavierbaren Behälter umgiessen und 12 min bei 121°C sterilisieren.
  • Inkubation: 3 Tage bei 35°C oder 5 Tage bei 30°C
Grundnährmedium für Bakterien: Standard-Nährbouillon  Rezept 4       bzw. Festes Nährmedium für Bakterien: Standard-Nähragar  Rezept 5
  •    - 2.5 g Nährbouillon  (Info, Datenblatt)                                                              - 2.5 g Nährbouillon  (Info, Datenblatt)  auch als Standard-Nähragar I* (Info)    
  •    - ad 100 mL Wasser (dest. oder entionisiert)                                                    - ad 100 mL Wasser (dest. oder entionisiert)          
  •    - pH auf 7.5 plus/minus 0.2 einstellen                                                                - 1.5 g Agar-Agar (Info, oder Agar-Agar aus einem Reformhaus (z.B. Info))
                                                                                                                                           - pH auf 7.5 plus/minus 0.2 einstellen      
  • Zubereitung:
     Das Standard-Nährmedium wird zur Züchtung und Zählung anspruchsvoller Bakterien eingesetzt. Durch Zugabe weiterer Bestandteile kann das Grund-
     nährmedium einfach zu Spezialnährböden angereichert werden.
     2.5 g Nährbouillon (Rezept 5: 1.5 g Agar) pro 100 mL Wasser suspendieren und gut durchmischen.
     Die Sterilisation erfolgt durch Autoklavieren im Schnellkochtopf  für 12 min bei 121°C.
     Inkubation: bei 35°C plus/minus 2°C während 18 - 24 h.
Universal-Bier-Agar (Basis): zur Kultivierung bierverderbender Mikroorganismen (Abb. 25)   Rezept 6      
  •    Zusammensetzung: siehe Info, Datenblatt)
  •    - 5.5 g Bieragar 
  •    - ad 75 mL Wasser (dest. oder entionisiert)
  •    - 25 mL Bier zusetzen
  •    - pH auf 6.3 plus/minus 0.2 einstellen 
     Hinweis: Der Universal-Bier-Agar (Basis) ist ein nicht-selektiver nährstoffreicher Agar, der Wachstum, Erholung und
     Isolation von Hefen und Bakterien unterstützt. Das Medium stimuliert das Wachstum bierverderbender Mikroorganis-
     men wie Lactobacilli, Pediococci, Acetobacter und Zymomonas spp. Für einen selektiven Nachweis dieser Kontaminanten
     wird Cycloheximid zugegeben (1 mg/1L) --> Hemmung der Brauhefe. Die Zugabe von Bier fügt Hopfenbestandteile und
     Alkohol dazu und minimiert so falsch positive Ergebnisse, indem kontaminierende Luftkeime abgetötet werden.
  • Zubereitung:
     - 5.5 g Bieragarbasis pro 75 mL Wasser suspendieren
     - gut durchmischen und unter häufigem Rühren und Schütteln erhitzen
     - 1 min lang kochen lassen bis Medium vollständig gelöst
     - zum heissen Medium 25 mL entgastes (CO2-freies) Bier zugeben
     - gut durchmischen und in geeignetem Gefäss (z.B. Erlenmeyerkolben) sterilisieren: Schnellkochtopf, 10 min bei 121°C 
     - auf ca. 50 - 45°C abkühlen lassen, nochmals gut aber luftblasenfrei durchmischen und in Petrischalen giessen 
     - fertiger Bieragar: Bernstein-farben, leicht glänzend; bei 8 - 15°C lagern
     - Inkubation: beimpftes Medium bei 28 - 30°C während 3 Tagen.  Lactobacillus microaerophilus, Pediococci und
       Zymomonas: aerob inkubieren; Acetobacter-Nachweis: anaerob inkubieren, z.B. in mit CO2-gefülltem und dann gut
       abgeschlossenem Gefäss.

Abb. 24. Luftkeime (Bakterien, Pilze) auf Standard-Nähragar. Unerwünscht bei allen Schritten des Brauprozesses.

Abb. 25. Bieragar zum Nachweis von eher unerwünschter Begleit-flora in und rund ums Bier.

Bier mit antibiotisch wirkenden Hopfen-bestandteilen und der Basis des Bier-agars ergeben das Nährmedium zum Nachweis der mikrobiellen Bierverderber.

 
 
Braulabor 8: Nährmedienzubereitung für Hefen und Bakterien
2.4. Herstellung steriler flüssiger und fester Nährmedien (Sterilisation, Autoklavieren)
Je nach Verwendung werden die oben beschriebenen Nährmedien eingesetzt. Vor dem Einsatz müssen die Nährmedien aber zwingend sterilisiert (= autoklaviert) werden, da die Ausgangsstoffe nicht steril sind und deshalb Fremdkeime eingeschmuggelt werden könnten.
 
Verfahrensweise: 
  1. Rezept: Nährmediumrezept je nach Verwendungszweck aus 2.2 (Hefen) bzw. 2.3.2 (Bakterien) auswählen und auf gewünschtes Endvolumen umrechnen (z.B. 500 mL: 5 x aufgeführte Mengen multiplizieren).
  2. Kulturgefäss: geeignetes Kulturgefäss auswählen (Erlenmeyerkolben [EMK] oder Becherglas [BG] für Flüssigmedien: 2-3-mal so gross wie Endvolumen, damit es gründlich umgeschüttelt werden kann).
  3. Gefässreinigung: EMK/ BG gründlich reinigen und mit ention. Wasser gut nachspülen. RG werden nicht direkt mit den Nährmedien gefüllt und sterilisiert, sondern zunächst, mit passenden Alukappen abgedeckt in einem Vernichtungsbeutel leer sterilisiert: vgl. Abb. 26, Abb. 27).
  4. Lösungsmittel Wasser: zur Nährmediumbereitung nur dest. bzw. entionisiertes (demineralisiertes) Wasser verwenden, etwa die Hälfte der erforderlichen Wassermenge in einem Messzylinder abmessen und ins Gefäss geben.
  5. Abwägen: Nährbodenbestandteile auf einer mit Alufolie abgedeckten, Null-tarierten
       mindestens 0.1 g genauen Waage einzeln abwägen, in das Gefäss einbringen und
       schütteln. Wichtig: der verwendete Spatel oder Löffel muss vor jeder Chemikalien-
       entnahme sauber gereinigt werden (abspülen, abtrocknen). Sehr kleine Substanz-
       mengen können bei mangelnder Wägegenauigkeit auch zunächst in höherer
       Konzentration angesetzt werden (= sog. Stammlösung) und daraus dann zudosiert
       werden (Volumenzunahme beachten für Endwasserzugabe!).
  6. Endwasser: restliche Wassermenge zur Erreichung des gewünschten Endvolumens
      zugeben.
  7. Sterilisieren/ Autoklavieren:     
       --> Tipps und Abb. 14 bei Braulabor 6 - Minimaltechnik 6 zwingend beachten                                                                 
     - Gefässe verschliessen: EMK mit Alukappe + Alufolie bzw. gerollter Watte + Alufolie,
          oder doppelter Alufolie, BG mit doppelter Alufolie (cf. Abb. 27), RG mit Alukappen in
          sterilisierbaren Vernichtungsbeutel einfüllen und Beutel verschliessen  
        - Schnellkochtopf mit ention. Wasser bis zur Lochplatte beschicken, Sterilisationsgut
          einfüllen sodass der Deckel aufgesetzt werden kann (cf. Abb. 14)  
        - Schnellkochtopf verschliessen, auf Heizplatte/Herd stellen und erhitzen - zunächst
          auf hoher Heizleistung, bei Erreichen der Sterilisationstemperatur
          121°C  = 2. roter Ring im Druckventil sichtbar die Heizleistung zurück fahren und 
          so einregeln, dass immer gerade der 2. rote Ring sichtbar bleibt.
     8. Sterilisationszeit: die Flüssigkeiten in den Gefässen müssen zunächst aufgeheizt
         werden = Aufheizzeit; erst dann folgt die eigentliche Sterilisation =
         Sterilisationszeit. Gesamtzeit: Aufheizzeit + Sterilisationszeit.            
         Aufheizzeit: je nach Volumen - bis 50 mL ca. 5 min, 50 - 100 mL ca. 8 min,
         100 - 500 mL ca. 12 min.                                                                                                            
         Sterilisationszeit: i.d.R. 15 min bei 121°C (längere Zeiten sollten bei Nährmedien
         vermeidet werden, da sonst hitzelabile Substanzen wie Vitamine denaturiert werden.
     9. Abkühlen: Nach Erreichen der Sterilisationszeit Schnellkochtopf von der abgestellten
         Heizplatte entfernen und auf eine hitzefeste Unterlage stellen; warten, bis der Innen-
         druck ganz abgefallen ist (rote Ringe nicht mehr sichtbar) - kein forciertes Abkühlen 
         z.B. mit kaltem Wasser, da sonst beim Öffnen die Flüssigkeiten in den Gefässen
         immer noch eine Temperatur von über 100°C aufweisen und dann mit hoher
         Geschwindigkeit entweichen könnten  --> eine Art Siedeverzug mit gefährlichen
         Folgen, wenn diese heissen Flüssigkeiten auf Haut/ Gesicht gelangen !!      
         Wichtig: genügend lange abwarten, bis auch das Sterilisationsgut unter 80°C abgekühlt
         ist --> mindestens noch 15 min nach sichtbarem Verschwinden der roten Ringen warten.
   10. Anschlussverfahren nach der Sterilisation:                                                                                                                                                                   - EMK mit Festmedien: müssen vor dem Abkühlen gegossen werden, z.B. in sterile
           Petrischalen oder RG --> cf. 2.5.1. "Giessen von Nähragarplatten"                                
         - RG für Schrägagarkulturen: können nach dem Abkühlen mit den noch heissen
           agarhaltigen Medien gegossen werden --> cf. 2.5.2. "Giessen von Schrägagar" 
         - EMK mit Nährlösungen: können nach dem Abkühlen mit der Hefe ab Schrägagar-
           Stammkultur beimpft werden --> cf. xxx "Beimpfen einer Flüssigkultur".                                      
2.5. Verarbeitung steriler Nährmedien
2.5.1. Giessen von Nähragarplatten
Das noch heisse und damit flüssige Nährmedium mit Agar (z.B. Malzagar, 
spezifische Bakteriennährböden für z.B. Milchsäurebakterien) wird direkt aus
der Erlenmeyerkolben in sterile Einweg-Petrischalen (oder im Backofen in
Heissluft sterilisierte Glaspetrischalen) gegossen.
Vorgehen:
- Arbeitsplatz mit 70%-Ethanol oder Isopropanol entkeimen (kräftig einspritzen, mit 
  frischem Kosmetiktüchlein gleichmässig verteilen, ca. 60 sec einwirken lassen und
  dann abwischen)
- zwischen zwei brennenden Gasbrennern die sterilen Petrischalen seitlich in einem
  Stapel platzieren. Vorsicht: weder mit losen Kleidungsstücke noch (langen) Haare in
  die Nähe der Flammen geraten! 
- mit Handschuhen geschützt den noch heissen EMK mit dem flüssigen Agarmedium
  (ideal zwischen 45-55°C) öffnen (Alukappe/ Alufolie und Wattepfropfen) wegziehen
  und den Rand des EMK in der Gasflamme während ca. 2 sec unter Drehen abflammen
  (cf. Abb. 28A).
- Petrischale ab Stapel auf Arbeitsfläche platzieren, mit der einen Hand Deckel wenig
  abheben (nicht ablegen!) und soviel heisses Nährmedium ausgiessen, dass sich die
  Bodenschale gerade selbstständig mit der Agarlösung bedeckt (= ca. 18-25 mL, bzw.
  ca. 1/3 bis maximal 1/2 der Petrischale füllen, cf. Abb. 28B)
- dann sofort mit dem Petrischalendeckel schliessen und den EMK-Rand wieder ganz
  kurz abflammen; gegossene Petrischalen stapeln (--> resultiert in weniger störendem
  Wasserdampf im Petrischalendeckel)
- restliche Petrischalen mit dem Nährmedium identisch giessen und evtl., falls sich das
  Nährmedium nicht ganz verteilt hat, durch leichte Rotation der geschlossenen Petri-
  schale nachhelfen (cf. Abb. 28C)
- so lange Abkühlen lassen, bis sich der Nähragar verfestigt hat; dann sind sie zur
  Beimpfung einsatzbereit
- Aufbewahren: cf. Abb. 28D, Abb. 31. 
  Dauert es länger als einen Tag bis zur Beimpfung der Malz- bzw. Bakterienagarplatten,
dann sollten diese umgekehrt in der Originalplastikhülle Petrischalen umgekehrt (Boden-
platte nach oben, Deckel nach unten orientiert) aufbewahrt werden. Nachteil: es kann sich
lästiges Kondenswasser am Petrischalendeckel bilden; Abhilfe: ca. 1/2 Tag vor der Nutzung bei Zimmertemperatur stehen lassen.

Abb. 28. Feste Nährmedien giessen.

A: EMK abflammen.  B: Heisses Agarmedium in Petrischalen giessen.  C: Durch Rotation Agarmedium gleichmässig ver-teilen.  D: Aufbewahrung der Nähragarplatten im Kühlschrank bei 4°C.

Abb. 26. Grundlage Nährmedien und Glaswarenzubehör.

Links oben: Malzextrakt-Bouillon (oder einfach helles Trockenmalzextrakt-pulver, Agar-Agar als Verfestigungsmittel, Malzextraktagar (Fertigmischung anstelle der einzelnen Komponenten), Hefenährmischung (z.B. Wyeast nutrient blend), Maltose. 

Links unten: Reagenzgläser mit Alukappen in Vernichtungsbeutel, mit Sterilisationsindikatorstreifen; EMK mit Zellulosestopfen; Schikanen-EMK (SEMK) mit Alukappe; SEMK Drehverschlusskappe; SEMK mit Aluminium-folie über darunter liegender Alukappe und mit Sterilisationsindikator; SEMK nach Sterilisation: schwarze Schrägstreifen beim Sterilisations-indikator; Spatel und mindestens 0.1g genaue Waage (Digital Scale mit 0.01g-Genauigkeit, Info).

Abb. 27. Verschluss der Kulturgefässe   (--> Handlingtipp Nr. 9)

Selbstgefertigte Wattepropfen für EMK: mit Schere etwa quadratisches Wattefeld ausschneiden, halbieren, straff rollen; Alufolie: alle Gefäss-verschlüsse sollten noch zusätzlich mit Alufolie abgedeckt werden (cf. Abb. 14 und Abb. 24 unten rechts).

mittlere Reihe: kleine Alukappen für RG (stehend, liegend), grosse Alu-kappen für EMK (stehend, darunter: liegend), Drehverschluss für SEMK; Alukappe aus Alufolie; kommerzieller Wattepfropfen links neben blauer Alukappe; Entsorgungsbeutel: zum Einpacken von RG vor Sterilisation (cf. Abb. 24 unten links), als Ersatz für Entsorgungsbeutel können auch sog. backofenfeste Bratschläuche (z.B. Toppits: Info) verwendet werden 

2.5.2. Giessen von Schrägagarröhrchen zur Hefestammhaltung (Schrägagarkulturen)
Die randlosen Reagenzgläser mit den passenden Alukappen (vgl. Abb. 4) werden separat in einem
geschlossenen Vernichtungsbeutel im Schnellkochtopf bei 121°C während 15-20 min autoklaviert
und können so auch längere Zeit steril aufbewahrt werden. Von Vorteil ist ein Sterilindikatorband,
das anzeigt, dass die RG sterilisiert wurden (cf. Abb. 29).
Vorgehen:
- Arbeitsplatz mit 70%-Ethanol oder Isopropanol entkeimen (kräftig einspritzen, mit frischem
  Kosmetiktüchlein gleichmässig verteilen, ca. 60 sec einwirken lassen und dann abwischen)
- Arbeitsplatz einrichten: sterile RG im RG-Gestell oder auf Unterlage liegend, EMK mit heissem
  Malz-Anzuchtmedium bzw. Malz-Festmedium, Unterlage für RG (z.B. Holzleiste, fester Schlauch,
  cf. Abb. 29 und 30), 2 Gasbrenner  
- zwischen den zwei brennenden Gasbrennern vom EMK mit dem heissen Malzmedium mit der 
  einen behandschuhten Hand die Verschlusskappe entfernen, keimarm mit der Öffnung nach
  unten deponieren, die EMK-Mündung  abflammen (Abb. 28A), gleichzeitig mit der anderen
  Hand die Alukappe des RG mit Klein- und Ringfinger abziehen und ebenfalls die Mündung des
  RG abflammen
 
- vorsichtig in das RG soviel* heisses Nährmedium einfliessen lassen, dass die Agarverteilung bei
  der nachfolgenden Schräglagerung etwa die Verhältnisse in Abb. 30 aufweist  (*d.h. ca. 1/3 des
  RG = xx mL - vorher unsteril mit Wasser austesten!). Es können anstelle von einzelnen RGs auch
  RG-Gestelle für grössere Mengen an Schrägagarröhrchen eingesetzt werden
- RG wiederum an der Mündung abflammen, mit der Alukappe verschliessen
  und auf Holzleiste schräg lagern, bis das Nährmedium erstarrt ist
- Schrägagarröhrchen können jetzt beimpft werden (cf. separate Anleitung
  3.1.1) oder im beschrifteten Plastikbeutel (Datum, Mediumtyp) eingeschlos-
  sen im Kühlschrank bei ca. 4°C gelagert werden (Abb. 31)
Tipp: Lagerung fertig zubereiteter Nährböden (Petrischalen, Schrägagar)
 Fertig zubereitete feste Nährmedien sind nur begrenzt haltbar: 6-8 Wochen; 
Bedingungen: 4°C, lichtgeschützt, verdunstungsgeschützt in gut verschlosse-
nem Plastikbeutel (cf. Abb. 28D, 31), bei Zimmertemperatur nur etwa 1 - 2
Wochen.

Abb. 30. Schrägagarröhrchen. Korrekte Lagerung nach dem Giessen auf Unter-lage, Massenlagerung im RG-Gestell.

Abb. 29. Arbeitsplatz zum Giessen von Schrägagarröhrchen. Mit 70% Ethanol entkeimte Keramikplatte als Arbeitsplatzgrund-lage, 2 brennende Gasbrenner, Holzleiste als Unterlage für frisch gegossene RG (links) und sterile RG (rechts), die noch gegossen werden müssen, Erlenmeyerkolben mit warmem Malzagar.

 
3. Grundlagen: Impfen, Anzucht, Stammhaltung von Hefen und Bakterien
3.1. Einführung
Unter Impfen versteht man die Übertragung einer gewissen Menge vermehrungsfähiger Mikroorganismen (= Impfmaterial, Inokulum) auf oder in einen sterilen Nährboden bzw. Nährlösung zum Zweck der Kultivierung, z.B.
  • als über längere Zeit haltbare Stammkultur (festes Nährmedium im Schrägagarkulturröhrchen, Nähragarplatten)
  • zur Kontrolle der Reinheit bzw. zur Gewinnung von Reinkulturen mittels des Ausstrichverfahrens (Verdünnungsausstrich --> Erzielen von Einzelkolonien),
  • als Flüssigkultur (für Hefestarter).
Begriffliches.
Die traditionelle Methode der Aufbewahrung von Mikroorganismen wie Hefen ist das periodische Überimpfen der Kulturen auf frischen Nährboden (z.B. als
Schrägagarkultur, bzw. Würzeschrägagarkultur). 
  Dieses aufwändige Verfahren ist geeignet zur Anlage von
Arbeits-oder Gebrauchskulturen für den häufigen Bedarf. Man impft die Kulturen z.B. wöchentlich von einer Stammkultur (cf. unten) ab.
  Häufig verwendet man das regelmässige Überimpfen auch zur Langzeiterhaltung von Mikroorganismen in Form von
Stammkulturen (= zur Stammhaltung z.B. eines bestimmten Hefestammes).
  Um den Aufwand als Heimbrauer gering zu halten, eigen sich auch sog. Dauerkulturen in 10%iger  Saccharoselösung. Wesentlich besser lassen sich
  Hefen als
Paraffin-Dauerkulturen halten.
Lagerung und Aufbewahrungsdauer.
Hefekulturen sollten durch gasdichten Verschluss der Kulturgefässe vor Austrockung
geschützt im Dunkeln und in der Kühle bei 4 - 6C° gelagert werden (--> Reduzierung der
Stoffwechselaktivitäten sowie Wachstumsgeschwindigkeit). Dazu eignen sich z.B. Röhrchen
mit Folien abgedichtet und im Vernichtungsbeutel eingeschlossen, Röhrchen und EMK mit
Schraubgewinde.
Die maximal mögliche Aufbewahrungsdauer zwischen Überimpfungen ist allerdings je nach
Organismus, Nährboden und Lagerungsbedingungen sehr unterschiedlich:
  • Schrägagarkultur: 3 Monate, manchmal bis zu 12-24 Monate
  • Saccharose-Dauerkultur: 6 Monate
  • Paraffinöl-Dauerkultur: > 10 Jahre.  Mehr Info: PDF-Dokument "Aufbewahrung von Hefen"
Bei allen Verfahren muss stets geachtet werden, dass keine Kontamination (Verunreinigung)
durch Fremdmikroorganismen auftritt  (--> Kontrolle durch Ausstrichverfahren, cf. separate
Anleitung). Auch sollte die ursprünglichen Stammeigenschaften erhalten bleiben, d.h. keine
Schädigung der Zellen noch genetische Veränderung durch spontane Mutationen. 
Eine sichere langfristige Aufbewahrung ist letztlich möglich nur durch
  • Vakuumtrocknung: Trocknen der Hefezellen im Vakuum (ohne vorheriges Gefrieren
       wie bei der Gefriertrocknung) --> aktive Brautrockenhefe (Abb. 32). Die Rehydration
       erfordert Sorgfalt und sollte gemäss den Anleitung des jeweiligen Hefelieferanten
       durchgeführt werden (z.B. genaue Anweisungen bei Lallemand am Bsp. der Münchner
       Weissbierhefe: Info 1 Übersicht aller Trockenhefen)  > Info 2 Munich Wheat Beer Yeast  >  
       Info 3  Technical Data Sheet S. 2: Rehydration. Haltbarkeit: bei Lagerung im Kühlschrank untergärige Hefe: 1 - 2 Jahre, obergärige Hefe 2 - 3 Jahre.
 
  • Gefrierkonservierung - Kryokonservierung: diese beste Konservierungsmethode für alle  Mikroorganismen ist eine Tieftemperatur-Konservierung, bei der den Hefezellen zunächst das Wasser entzogen und der Zellinhalt stark konzentriert wird.  Man verwendet "Kryoröhrchen" mit einem Fassungs-vermögen von 2 mL. Das Einfrieren und das Wiederauftauen sind allerdings heikle Prozesse, die 1. durch Bildung von Eiskristallen und 2. durch die Zunahme der innerzellulären Konzentration an gelösten Stoffen (Elektrolyten) sowie weiterer Faktoren wie DNA-Brüche zu
       einer Schädigung und zum Tod der Zellen führen kann. Die Kryoröhrchen wie beispielsweise Cryoinstant oder
       Roti-Store Hefe-Cryoröhrchen bestehen jeweils aus 25 porösen Perlen in einem mit einer glycerolhaltigen Bouillon
       (Trehalose, Saccharose, Aminosäuren sowie Makromoleküle wie PVP (Polyvinylpyrrolidon) und HES (Hydroxyethyl-
       stärke) als "Zellschutzmittel" gefüllten Fläschchen (Abb. 33). Mikroorganismen binden an die poröse Oberfläche
       der Perlen. Die überschüssige Bouillon wird vollständig abpipettiert, die Röhrchen können im Gefrierschrank bei
       bis zu -70°C gelagert werden. 
       Als Heimbrauer bleibt nur die Tiefkühltruhe mit maximalen Tiefte​mperaturen von ca. -25 bis -27C°.
       Haltbarkeit: mehrere Jahre.
       Genaue Anleitung: Braulabor 15: PDF-Dokument "Hefe-Stammkulturen in Hefe-Cryoröhrchen".

Abb. 32. Gewinnung von Brautrockenhefen.

[Quelle: Fermentis-Broschüre]. Siehe auch hier.

Abb. 33. Hefe Cryoröhrchen mit 25 porösen Glaskügelchen.

[Quelle: Carl Roth AG]

Abb. 31. Lagerung mikrobiologischen Materials.

Links: Hefereinkultur in Schrägagarröhrchen (Alukappen mit zusätz-licher Folie abgedichtet). EMK mit sterilerNährlösung.

Mitte: EMK mit sterilem Malzagar (vor Einsatz durch vorsichtiges Erwärmen auf ca. 45°C wieder verflüssigen).

Rechts: noch nicht beimpfte Schrägagarröhrchen (in Sterilisations-beutel/Plastikbeutel gut verschliessen).

Wichtig: alles Material immer gut beschriften (Bezeichnung, Datum). 

Braulabor 9: Kultivierung von Mikroorganismen (Hefen, Bakterien) in flüssigen Nährmedien
3.2. Anzucht von Mikroorganismen in Flüssigkulturen 
Hefen und andere erwünschte Mikrooganismen müssen zunächst immer in Flüssigkulturen angezogen werden. Diese können dann als Starterkultur verwen-det werden oder zur Anlegung von Stammkulturen in Form z.B. einer Würzestammkultur oder auch Kryokultur.
 
Vorüberlegungen
Vor jeder Organismenkultur sollte man sich zur Wahl des richtigen V erfahrens die folgenden Fragen stellen:
- Mikroorganismus: welcher Hefestamm (bzw. Bakterienstamm) eignet sich optimal für das gewählte Biersorte? --> Auswahl z.B.     Wyeast      White Labs
  Fermentis      Hefesuche Müggelland      weitere Hefelieferanten
- Nährmedium: weclhes Nährmedium kommt zur Anzucht in Frage?
- Kulturgefäss: welcheAnzuchtgefässe eignen sich für die gewünschte Organismenmenge (Volumen in mL) und der zur Verfügung stehenden Anzuchttechnik
  (einfach bei ZT stehen lassen, Magnetrührer, Temperatur [Umgebungstemperatur, Brutschrank])
- Organismenmaterial: in welcher Form steht das Organismenmaterial zur Verfügung (z.B. Wyeast- oder White Labs-Flüssigkultur, Schrägagar-Stammkultur 
  bzw. Arbeitskultur, Trockenhefe)
- Anzuchtbedingungen: welche Wachstumsbedingungen sind zu beachten (Temperatur, pH-Wert, aerob - anaerob u.a.)
--> die Beantwortung dieser Fragen führt zwangsläufig zur Wahl des richtigen Kulturgefässes (vgl. Abb. 34, auch Abb. 6 und 7):
  • Erlenmeyerkolben 100 - 3000 mL: ohne oder besser mit Schikanen (wirksamere Durchmischung
       und Belüftung) - für Flüssigkeitskulturen aerober* sauerstoffbedürftiger) Mikroorganismen
       von ca. 100 bis 2000 mL. Verschluss: Wattepfropfen oder Alukappe, darüber Alufolie.
  • Kulturröhrchen 1 - 10 mL:  Kulturröhrchen besitzen im Gegensatz zu normalen Reagenzgläsern
       eine dickere Wand und einen geraden Rand. Verschluss: Wattepfropfen oder Alukappe oder
       Schraubdeckelverschluss, darüber Alufolie.
  • Petrischalen 15 - 20 mL: aus Boden und Deckel bestehende Doppelschalen aus wiederverwert-
       barem Glas oder Kunststoff für Einmalgebrauch, meist nur für verfestigte Nährlösungen
       (= Nähragarplatten) für sog. Oberflächenkulturen eingesetzt.
  • Hefeflaschen Pyrexglas 500 mL (Abb. 23 B): zur Anzucht und Aufbewahrung von flüssigen Hefe-
       kulturen.
  • Hefebox Kunststoff 1400 mL mit Ventil (Abb. 23B): nicht autoklavierbar, zur Aufbewahrung von
       Hefen.
  • Dreihals-Kulturflasche 125 mL: sehr schonende Anzucht von Mikroorganismen möglich, da von
       oben aufgehängter Rühreinsatz sanftes Rühren ermöglicht.
Kultivationstechniken
Die Kultivierung von Mikroorganismen umfasst zwei Schritte:
1. Beimpfung des sterilen Nährmediums (flüssig oder fest) mit kleiner Keimmenge (Inoculum)
2. Anzucht bei den notwendigen Wachstumsbedingungen (pH, Sauerstoff: aerob mit O2,
    anaerob ohne O2, Temperatur).
3. Anzuchtvarianten:
    - Variante 1: Schrägagarröhrchen (Stammkultur oder Arbeitskultur) --> Beimpfen steriler
      flüssiger Nährmedien und aerobe Kultur --> Braulabor 9: PDF-Dokument  "Kultivierung von Hefen in flüssigen Nährmedien"
    - Variante 2: Schrägagarröhrchen (Stammkultur oder Arbeitskultur) oder Hefen-Flüssigkultur
       --> Beimpfen  steriler fester Nährmedien (Schrägagar oder Nährbodenplatte)
       --> Braulabor 14: "Hefe-Stammkulturen auf Schrägagar"
    

Abb. 34. Hefe-Anzuchtgefässe (ohne Hefen, ohne Alufolienab-deckung: wird erst beim Autoklavieren über Verschlüsse gepackt.

A: Erlenmeyerkolben (EMK) mit Schikanen auf Magnetrührer.

B: Dreihals-Kulturflasche (autoklavierbar) auf heizbarem Magnet-

     rührer, mit Temperaturfühler und regulierbarer Heizung (Info).

C: EMK auf Magnetrührer in temperaturkontrollierter Brutkammer.

Beimpfung Flüssigkulturen:

PDF zur genauen Anleitung

 

Abb. 35. Abflammen der Impföse ist bei jeder Über-

impfung zwingend notwendig.

Braulabor 10: Kultivierung von Hefen auf festen Malzagarmedien
Die Kultivierung von Hefen (inkl. Bakterien) auf festem Nähragar umfasst immer zwei Schritte: 1. die Beimpfung des sterilen Nährmediums  mit einer kleinen Keimmenge, und 2. die Anzucht bei den notwendigen Wachstumsbedingungen (pH, Sauerstoff [aerob], Temperatur als wichtigste Parameter und in der Regel ohne Licht [Ausnahme der Fotosynthetiker - aber die spielen bei den Brauern sowieso keine Rolle]).  Bei diesen sog. Oberflächenkulturen steht den auf der Agaroberfläche wachsenden Mikroorganismen stets genügend Sauerstoff zur Verfügung, sofern die Kulturgefässe Petrischalen oder Kulturröhrchen nicht hermetisch dicht abgeschlossen werden. Die Anzuchttemperatur sollte am oberen Ende der empfohlenen Temperaturen der jeweiligen Hefestämme liegen (Info: ), anschliessend erfolgt die Lagerung in den gut verschlossenen Anzuchtgefässen (Kulturröhrchen, Petrischalen) bei Kühlschranktemperaturen, um ein rasches Austrocknen der Kulturen zu verhindern.
Verfahren: Wachtumsverfahren in flüssigen und festen Nährmedien
Material: kommerzielle Hefesuspensionen oder selbst kultivierte Flüssighefen, Hefen auf festen
Nährmedien (Schrägagar, Petrischalenkultur, Einzelkolonien auf festem Nährmedium, u.a.)
Methoden: Herstellung flüssiger und fester Nährmedien, Beimpfung mit Impföse (Ausstrichtechnik)
Beobachtungen: Wachstumstrübung in Flüssigkulturen, Koloniebildung ("Kolonienbänder", Einzel-
kolonien) auf Festmedien
Genaues Vorgehen: PDF-Dokument "Kultivierung von Hefen auf festen Malzagarmedien"

Abb. 36. Überimpfung von Hefen auf Malzagar mit der Impföse.

 
Braulabor 11: Bestimmung der Lebendzellzahl - Anlegen einer Verdünnungsreihe
Die Zelldichte (Hefezellzahl/mL) in bewachsenen Kulturen ist in der Regel viel zu
hoch für viele Analysen (z.B. direkte Zellzahlbestimmung, Lebenszellzahlbestimmung).
Daher muss die Ausgangsorganismenzellsuspension zunächst über eine sog. Verdün-
nungsreihe (vgl. Abb. 37) unter kontaminationsfreien Bedingungen verdünnt werden.
Üblicherweise wird in Dezimalschritten verdünnt, d.h. im Verhältnis 1:10 (0.1 bzw. 10^-1),
1:100 (0.01 bzw. 10^-2), 1:1000 (0.001 bzw. 10^-3). Der Klammerwert wird als Verdün-
nungsfaktor bezeichnet. Als Verdünnungsmittel wird meist sterile physiologische Koch-
salzlösung verwendet (0.9 % [wt/vol] NaCl. 
Verfahren: sterile Verdünnung und Ausplattierverfahren
Material: Hefesuspension, 0.9% NaCl steril als Verdünnungslösung
Methoden: 1:10er Verdünnungsschritte, Ausplattierung eines Aliquotes
Beobachtungen: Zellzahl nimmt zu einer optimal auszählbaren Koloniezahl (KBE*) ab
Genaues Vorgehen: PDF-Dokument "Lebendzellzahl durch Verdünnungsreihe"

Abb. 37. Prinzipschema einer Verdünnungsreihe.

Mit jedem Verdünnungsschritt (9 mL NaCl + 1 mL Hefesuspension) nimmt die Zahl der Hefezellen um den Faktor 10 ab, z.B. von 1'000'000 --> 100'000 --> 10'000 --> 1'000  --> 100.

 
Braulabor 12: Bestimmung der optischen Dichte einer Hefeflüssigkultur
2.4. Hexxx
Je nach Verwe
Verfahren: xx
Material: xx
Methoden: xx
Beobachtungen: xx

Abb. 38. Bestimmung der optischen Dichte mit dem Lowcost-Fotometer.

Bild + Text in Bearbeitung

 
Braulabor 13: Erzielung einer Einzelkolonie im Ausstrichverfahren  (Vereinzelungsausstrich/ Verdünnungsausstrich)
Die Erzielung von Einzelkolonien ist eine raltiv einfache Technik zur Überprüfung der Reinheit eines Hefestammes (z.B. als Flüssighefekultur, periodische Überprüfung von Stammkulturen auf Schrägagar, Gewinnung von Wildhefen aus Naturproben wie Oberflächen von Trauben) als auch zur Erzielung einer reinen Stammkultur
Bei der Vereinzelung sollen die Hefezellen mechanisch möglichst weit auseinander räumlich getrennt werden,
so dass sie auf dem Nähmedium einzeln zu liegen kommen. Die aus den vereinzelten Hefezellen wachsende
Nachkommenschaft wächst dann zu einer von blossem Auge sichtbaren Kolonie heran. Bei mehrmaliger
Anwendung dieser Vereinzelungstechnik ist die Wahrscheinlichkeit der Gewinnung einer Reinkultur sehr hoch.
Verfahren: Verdünnungsverfahren  flüssig und mechanisch
Material: Hefesuspension rein oder verunreinigte Mischkultur, sterile Verdünnungslösung, feste Nährmedien
Methoden: Verdünnungsreihe und Vereinzelungsausstrich
Beobachtungen: Einzelkolonien - optisch identisch (= Reinkultur)  oder verschieden (= Mischkultur)
Genaues Vorgehen: PDF-Dokument
"Erzielung einer Einzelkolonie - Vereinzelungsausstrich"

Abb. 39. Oben: Ausstrichtechnik: Erzielung einzelner Hefekolonien.

Abb. links: Dieser Hefestamm war schon über 2 Jahre (!) auf einer Schrägagar-Stammkultur, wuchs immer noch gut und zeigte keine mikrobielle Kontaminationen. Die sichtbaren Einzelkolonien können nun überimpft werden --> z.B. für eine neue frische Stammkultur.

PDF zur Anleitung Stammreinheit (ähnliche Arbeitstechnik)

Hefen_Vereinzelung.jpg
 
Braulabor 14: Hefe-Stammkulturen auf Schrägagar 
Periodisches Überimpfen von Mikroorganismen für kurz- bis mittelfristige Aufbewahrung auf frisch gegossene Schrägagarkulturröhrchen wird für Arbeits- oder Gebrauchskulturen* (= kurzfristige Aufbewahrung, wenige Tage bis Monate) für den häufigen Einsatz empfohlen. Diese häufiger eingesetzten reinen Hefekulturen impft man von sog. Stammkulturen* ab, die ebenfalls in Schrägagarkulturröhrchen gehalten werden (= mittelfristige Aufbewahrung, mehrere Monate bis maximal 1 Jahr). Damit vermeidet man die Gefahr einer Kontamination*, die beim Überimpfen ständig vorhanden ist.
Beimpfen einer Schrägagarkultur (Würzeschrägagarkultur) aus Flüssig-Hefekultur zur Stammhaltung
Von einer Reinkultur z.B. Wyeast- oder White Labs oder anderen Hefeproduzenten (cf. Hefestämme von: Wyeast Info, White Labs Info  Fermentis Info, Lalle-mand Info, Mangrove Jack's Info, Brewferm InfoGozdawa Info)  oder aus selbstisolierten Hefen lassen sich Reinkulturen herstellen, die man in der Regel über kürzere oder längere Zeit unter geeigneten Bedingungen kultiviert, um sie bei Bedarf jederzeit zur Verfügung zuhaben. 
Vorgehen:
- Arbeitsplatz mit 70%-Ethanol oder Isopropanol entkeimen (kräftig einspritzen, mit frischem   Kosmetiktüchlein  gleichmässig verteilen, ca. 60 sec einwirken lassen und dann abwischen)
- Arbeitsplatz einrichten:  2 Gasbrenner, RG-Gestell mit sterilen Schrägagrröhrchen (SA) , Impföse, Impfösenhalter (Ersatz: leeres RG im RG-Gestell), Hefe-
  kultur (eigene EMK-Starterkultur, Reste aus Reinzucht-Flüssighefe in z.B. Wyeast- oder White Labs-Packung, Trockenhefe-Rehydrierungsreste)
- immer zwischen den zwei brennenden Gasbrennern arbeiten, um Luftkontamination mit Fremdkeimen zu minimieren; Vorsicht: lose Kleider, lange Haare
  können Feuer fangen!
- "Hefequellengefässe" vor dem Hefetransfer aussen
   entkeimen: 
   Wyeast- oder White Labs-Packungen: geöffneten
   Packungsteil mit 70%igem Isopropanol besprühen
   und ca. 60 sec warten 
   EMK mit Flüssigkultur: Abflammen der EMK-Mündung
   (Abb. 28A)
   Schrägagagr-Stamm- oder Arbeitskultur: da diese
   Impfvariante vom Handling her relativ schwierig ist,
   gibt es dazu eine eigene ausführlichere Anleitung
   --> Braulabor 14 Variante 2: PDF-Dokument
        "Überimpfung Kulturröhrchen --> Kulturröhrchen"
- Impföse mit der einen Hand in der Gasflamme
  rotglühend erhitzen (Abb. 40A), mit der anderen
  Hand Mündung eines Schrägagarröhrchens ebenfalls
  abflammen (Alukappe mit Kleinfinger und Handfläche 
  vorher abnehmen und einklemmen: cf. Abb. 40B)  
- mit der Impföse aus der Hefensuspension bzw. aus den
  Hefepackungen bzw. aus geöffneter Schrägagar-Stamm-
  kultur eine Öse voll Hefematerial holen (langsames Heraus-
  ziehen und vorsichtig in offenes SA-Röhrchen einführen
- auf der Nähragaroberfläche des SA-Röhrchens Hefen
  in S-Linien ganz sanft ausstreichen (Abb. 41 li).
- SA-Röhrchenöffnung abflammen und mit der zwischen
  den Fingern eingeklemmten Alukappe wieder verschliessen
- Impföse ausglühen und im Halter ablegen
- beimpfte SA-Röhrchen beschriften (Datum, Hefestamm-
  bezeichnung, Nährmedium)
- beimpftes SA-Röhrchen bei Zimmertemperatur unter Licht-
  ausschluss wachsen lassen oder im Brutschrank bei einer
  definierten stammabhängigen Vorzugstemperatur bebrüten
  (meist zwischen 20 - 25°C)
- anschliessend RG-Alukappen mit einem Klebeband versiegeln und 
  im Kühlschrank unter Lichtausschluss  bei ca. 4°C aufbewahren
  (Abb. 31, 41 re).